[发明专利]一种用于核酸原位合成的固相载体及其制备方法

说明书

本发明提供了一种用于核酸原位合成的固相载体的制备方法，该制备方法通过分别对固相基底进行第一氨基化处理、长链修饰、第二氨基化处理来在固相基底的表面形成长链有机接头，然后再接枝可裂解连接物，从而形成固相载体，由此，提供了一套可以高效原位合成核酸的反应体系，从而实现核酸的高效合成。此外，还提供了一种由上述制备方法制备的固相载体以及包括上述固相载体的核酸芯片。通过本发明的制备方法，可以实现固相基底的有效选择，并且可以进一步提高核酸原位合成的效率和核酸产物的纯度。

技术领域

本发明涉及基因芯片领域，具体地，涉及一种用于核酸原位合成的固相载体及其制备方法。

背景技术

目前，采用亚磷酰胺法原位合成寡核苷酸已被广泛地使用。在该方法中，需要将待要合成的寡核苷酸3'-端的核苷，经可裂解连接物预先负载在固相载体上，然后将该载体放入反应柱并安装在寡核苷酸自动合成装置上进行自动化合成寡核苷酸。合成步骤如下：

(1)利用脱保护试剂将核苷的5'-OH基脱保护；

(2)亚磷酰胺核苷单体在活化剂的存在下与暴露出来的5'-OH基团发生偶联反应；

(3)通过盖帽试剂将未反应的5'-OH基封上；

(4)利用氧化剂将亚磷酸盐氧化。

通过重复上述合成循环，来合成具有目的序列的寡核苷酸，利用浓氨水等将可裂解连接物裂解，将最终合成的寡核苷酸从固相载体上切出得到目标寡核苷酸序列。

目前，商业化的寡核苷酸合成仪为柱式合成仪，此种仪器合成方法是将商品化的固相无机颗粒载体(例如多孔玻璃(CPG)载体)填充于反应柱中，然后进行自动化合成。随着对原位合成寡核苷酸序列的需要，此种寡核苷酸的柱式合成仪的缺点也越来越凸显，寡核苷酸柱式合成仪主要存在两方面问题：一是由于填充柱的局限性导致了合成仪的通量较小，单位时间内合成寡核苷酸序列种类比较少，已经不能满足目前的市场需求；另一方面是由于现有固相载体CPG制备技术的缺陷导致的。

现阶段商品化的CPG载体主要有三部分组成：一是固相基底材料多孔玻璃；二是用于核酸起始步骤合成的带有羟基保护基的可裂解连接物(可以是带有羟基保护基的单体或其它通用结构载体等)；三是用于连接固相基底和可裂解连接物的接头(如：丁二酸酐等)。由于目前商品化的CPG仅在多孔玻璃上实现，受多孔玻璃本身对核酸的吸附作用的影响，利用现有的商品化CPG在寡核苷酸合成过程中，存在寡核苷酸合成链越长，寡核苷酸合成能力降低的缺陷(包括寡核苷酸合成的纯度以及合成效率)。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本申请提出了一种用于核酸原位合成的固相载体的制备方法，并且提供了相应的固相载体。

根据本发明的第一方面，提供了一种用于核酸原位合成的固相载体的制备方法，其中，所述制备方法包括：

(1)利用氨基化修饰试剂对固相基底进行第一氨基化处理，得到第一氨基化的固相基底；

(2)利用长链接头修饰试剂对所述第一氨基化的固相基底进行修饰，得到长链接枝的固相基底；

(3)利用伯氨化处理试剂对所述长链接枝的固相基底进行第二氨基化处理，得到第二氨基化的固相基底；以及

(4)将带有保护基的可裂解连接物连接至所述第二氨基化的固相基底，得到固相载体。

在上述制备方法中，所述固相基底为硅材质诸如玻璃、石英、陶瓷，或聚苯乙烯，或Fe₃O₄。

在上述制备方法中，单位面积的固相基底所需要的第一氨基化修饰试剂的浓度为0.1％-30％，优选为1％-10％。