[发明专利]一种抗黄曲霉素G1（AFG1）的单克隆抗体制备方法

说明书

本发明公开了一种抗黄曲霉素G1（AFG1）的单克隆抗体制备方法，通过骨髓瘤与B淋巴细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞，并后期制备得到单克隆抗体，本发明步骤方法简单，效率高，得到的抗体效价可达1:10⁶，金标消线浓度为1ppb，IC50为0.2ppb。

技术领域

本发明属于抗黄曲霉素体技术领域，具体涉及一种抗黄曲霉素G1（AFG1）的单克隆抗体制备方法。

背景技术

黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉（aspergillus flavus）寄生曲霉（a.parasiticus）产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高，它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素，具有强烈的毒性和致癌性，它是目前化学致癌物中最强的一种致癌诱变剂，其毒性比氰化钾强10倍，其致癌性比二甲基亚硝胺强75倍，1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，其作用的靶器官主要为肝脏，在我国国标中规定，大米中的黄曲霉素含量不得高于10μg/kg，但是目前市场上没有抗AFG1的单克隆抗体，即使有效价也不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗黄曲霉素G1（AFG1）的单克隆抗体制备方法，以解决上述的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抗黄曲霉素G1（AFG1）的单克隆抗体制备方法，包括以下步骤：

S1：骨髓瘤细胞培养

骨髓瘤细胞细胞置于 37°C，5%CO2的培养箱中培养，调整细胞密度，当细胞密度达80%，留待使用；

S2： B淋巴细胞制备

选效价好且竞争好的的小鼠，采用尾静脉注射，将含有抗原的200ul生理盐水注射入小鼠体内，经2-4天，手术取出小鼠脾脏，然后将小鼠脾脏轻轻研磨，使脾脏组织分散为脾细胞，研磨结束后，用5ml移液管取3-5mlSF培养基冲洗细胞筛网，使上面的细胞通过筛网流至下面的培养皿中，并混匀所得细胞液，离心机离心分离得到B淋巴细胞；

S3：杂交瘤细胞融合

将S1得到的骨髓瘤细胞与S2得到的B淋巴细胞进行混合，使用离心机将混合细胞液离心，1200rpm/min，离心5min，离心结束后，弃上清，用SF培养基30ml重悬，继续使用离心机离心，1200rpm/min，离心5min，离心后弃上清， 用剪过尖端的蓝枪头吸取PEG 1ml，逐滴滴加到混合的骨髓瘤细胞与B淋巴细胞中，滴加完成后，轻轻吹吸混匀，混匀后使用蓝枪头在液面上转圈；结束后静置，滴加终止液，滴加完成后，用移液管轻轻搅动细胞以免细胞沉底，后进行终止反应结束后，使用离心机离心，1200rpm/min，离心5min，弃上清，得杂交瘤细胞混合液；

S4：融合杂交瘤细胞筛选

将S3得到的杂交瘤细胞混合液转移至加有HAT的培养基中，混匀后加入培养皿中，铺板到96孔板中，铺板后放于37℃，5%CO2培养箱中培养，后将HAT培养基换为HT培养基继续培养，可以筛选出融合成功的杂交瘤细胞；

S5：杂交瘤细胞筛选

杂交瘤细胞在融合后5-7天进行筛选，显微镜下观察微孔板中细胞的生长状态， 采用ELISA方法检测阳性细胞株，将阳性高的孔板标记好顺序,待阳性细胞生长占孔底面积的1/4至1/3时，可取样检测滴度、特异性、叉反应性，然后根据滴度结果测抗体特异性和交叉反应性，筛选出最优杂交瘤细胞；

S6：杂交瘤细胞亚克隆及筛选