[发明专利]一种抗黄曲霉素G1（AFG1）的单克隆抗体制备方法

权利要求书

1.一种抗黄曲霉素G1（AFG1）的单克隆抗体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：骨髓瘤细胞培养

骨髓瘤细胞细胞置于 37°C，5%CO2的培养箱中培养，调整细胞密度，当细胞密度达80%，留待使用；

S2： B淋巴细胞制备

选效价好且竞争好的的小鼠，采用尾静脉注射，将含有抗原的200ul生理盐水注射入小鼠体内，经2-4天，手术取出小鼠脾脏，然后将小鼠脾脏轻轻研磨，使脾脏组织分散为脾细胞，研磨结束后，用5ml移液管取3-5mlSF培养基冲洗细胞筛网，使上面的细胞通过筛网流至下面的培养皿中，并混匀所得细胞液，离心机离心分离得到B淋巴细胞；

S3：杂交瘤细胞融合

将S1得到的骨髓瘤细胞与S2得到的B淋巴细胞进行混合，使用离心机将混合细胞液离心，1200rpm/min，离心5min，离心结束后，弃上清，用SF培养基30ml重悬，继续使用离心机离心，1200rpm/min，离心5min，离心后弃上清， 用剪过尖端的蓝枪头吸取PEG 1ml，逐滴滴加到混合的骨髓瘤细胞与B淋巴细胞中，滴加完成后，轻轻吹吸混匀，混匀后使用蓝枪头在液面上转圈；结束后静置，滴加终止液，滴加完成后，用移液管轻轻搅动细胞以免细胞沉底，后进行终止反应结束后，使用离心机离心，1200rpm/min，离心5min，弃上清，得杂交瘤细胞混合液；

S4：融合杂交瘤细胞筛选

将S3得到的杂交瘤细胞混合液转移至加有HAT的培养基中，混匀后加入培养皿中，铺板到96孔板中，铺板后放于37℃，5%CO2培养箱中培养，后将HAT培养基换为HT培养基继续培养，可以筛选出融合成功的杂交瘤细胞；

S5：杂交瘤细胞筛选

杂交瘤细胞在融合后5-7天进行筛选，显微镜下观察微孔板中细胞的生长状态， 采用ELISA方法检测阳性细胞株，将阳性高的孔板标记好顺序,待阳性细胞生长占孔底面积的1/4至1/3时，可取样检测滴度、特异性、叉反应性，然后根据滴度结果测抗体特异性和交叉反应性，筛选出最优杂交瘤细胞；

S6：杂交瘤细胞亚克隆及筛选

将S5中筛选出最优杂交瘤细胞，加入含16%血清的HT培养基，混匀，混匀后铺板于96孔板中，铺板前需铺饲养细胞，铺板后放于37℃，5%CO2培养箱中培养，进行杂交瘤细胞亚克隆，当亚克隆后一周左右可进行亚克隆筛选，待克隆涨势较好，一个克隆有20-60个细胞以上时可取样筛选，取上清100ul检测阳性，选择阳性高的，并尽量选择单克隆的孔，待细胞涨势好并当细胞生长约占孔底面积的1/4至1/3后转入24孔，转孔前需在24孔板中铺饲养细胞，转孔后24h-72h进行滴度测定，选择滴度高的孔再次进行亚克隆，直至100%的孔为阳性，选出几株滴度高的且为单克隆的细胞株进行扩大培养，最后选出最好的一株细胞用于腹水制备，另选细胞进行培养液培养；

S7单克隆抗体提取

（1）体内培养：在小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，在5-8天后小鼠肚子鼓起，此时可取腹水，备50ml离心管，将20ml注射器针头插在小鼠腹部，下面放50ml离心管，来回抽动针头，腹水便流到离心管中，每次取3ml左右，一般取3~5次，直到取完为止，取出的腹水需放置于-20℃保存，腹水经纯化，得到单克隆抗体；

（2）体外培养：将杂交瘤细胞加入990ul的含16%血清的HT培养基中，混匀后计数，取相应数量的细胞于10ml含16%血清的HT培养基中，混匀后铺板于96孔板中，后放于37℃，5%CO2培养箱中培养，后期从培养液中提取单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的一种抗黄曲霉素G1（AFG1）的单克隆抗体制备方法，其特征在于：所述HAT筛选培养基配置方法为：RPMI-1640培养基+1×HAT+16%进口FBS +1×双抗，配置完成后在放置于4℃环境中保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种抗黄曲霉素G1（AFG1）的单克隆抗体制备方法，其特征在于：所述HT筛选培养基配置方法为：RPMI-1640培养基+1×HT+16%进口FBS +1×双抗，配置完成后在放置于4℃环境中保存备用。