[发明专利]一种提取鲍肝胰腺RNA的方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种提取鲍肝胰腺RNA的方法，具体为：鲍肝胰腺在液氮中磨碎后用Trizol进行组织裂解，加入氯仿乳化，用异丙醇和5M NaCl沉淀，后转入RNA吸附柱中，经75%乙醇和5M NaCl溶液洗涤，再经75%乙醇洗涤后用RNase‑free水溶解得到鲍肝胰腺总RNA，总RNA经75%乙醇和5M NaCl二次沉淀和后续再纯化，最终得到高质量的鲍肝胰腺总RNA，本发明不仅可彻底消除鲍肝胰腺总RNA沉淀过程中产生的褐色沉淀，使得到的鲍肝胰腺总RNA质量好、浓度高、稳定性好，而且操作简单、成本低廉；同时，对其它多糖和色素含量高的水产动物组织总RNA的提取有借鉴作用。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种提取鲍肝胰腺RNA的方法。

背景技术

鲍被誉为海产“八珍之冠”，具有很高的营养和药用价值。2017年全国鲍鱼产量为14.85万吨，较2016年增幅10.24%，为经济贝类养殖中产量增幅最快的品种，具有重要的研究价值。肝胰腺为鲍的重要免疫组织，在对其进行免疫学研究时，肝胰腺RNA的提取是一个重要的环节。实时荧光定量、Northern杂交及转录组测序等分子生物学研究的开展都需要纯度高、完整性好的总RNA。

由于鲍肝胰腺中含有大量的多糖及色素，在RNA的提取过程中容易与RNA一起形成褐色沉淀，使得提取得到的RNA纯度不高、检测的总RNA含量不准，严重影响定量结果及cDNA文库的构建，使得后续实验无法进行。目前，传统的Trizol提取方法可高质量的提取鲍外套膜、鳃和足的总RNA，但在肝胰腺总RNA的提取过程中会产生褐色沉淀且无法去除，市售RNA提取试剂盒对提取得到的肝胰腺总RNA质量仅能起到改善作用，也无法从根本上去除褐色沉淀，且RNA提取质量不稳定。因此，有必要建立一种适用于鲍肝胰腺总RNA的提取方法，以满足响应分子生物学实验的需求。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种提取鲍肝胰腺RNA的方法，采用该方法得到的鲍肝胰腺总RNA质量好，浓度高，稳定性好。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种提取鲍肝胰腺RNA的方法，包括以下步骤：

S1、取鲍肝胰腺，在液氮中磨碎后，转入含有Trizol的RNase-free EP(eppendorf)管中（该EP管一般为1.5 mL管），混匀后离心，取上清液转入新的RNase-freeEP管中；

S2、往S1的上清液中加入1/5上清液体积的氯仿，通过震荡等方式混匀充分乳化呈乳白色，室温静置2-5 min，离心后取上清液转入新的RNase-free EP管中；

S3、往S2的上清液中分别加入与上清液等体积的异丙醇和5mol/L NaCl（即5 MNaCl），混匀，分两次将得到的溶液和沉淀一起转入RNA吸附柱中，离心后弃掉收集管中的液体；

S4、往S3的RNA吸附柱中加入75%体积分数的乙醇和5 M NaCl，室温静置2-5 min，离心后弃掉收集管中的液体；

S5、往S4的RNA吸附柱中加入75%体积分数的乙醇，室温静置2-5 min，离心后弃掉收集管中的液体；

S6、将S5的RNA吸附柱放入2 mL收集管中，离心2-4 min；

S7、将S6的RNA吸附柱充分晾干；

S8、将S7的RNA吸附柱转入一个新的无RNase的1.5 mL离心管中，加入RNase-free水室温放置2 min，离心后得到鲍肝胰腺总RNA；

S9、往S8的离心管中加入75%体积分数的乙醇和5 M NaCl进行二次沉淀，充分混合后静置2-5 min，将混合物转入RNA吸附柱中，离心（该离心时间一般为30s）后弃掉收集管中的液体；