[发明专利]一种采用槟榔提取物与机械摩擦建立口腔粘膜纤维性变动物模型的建立方法

说明书

本发明公开了一种采用槟榔提取物与机械摩擦建立口腔粘膜纤维性变动物模型的建立方法。采用乙醇回流萃取法制备槟榔提取物，选取健康的SD大鼠作为模型动物，对照组：不作任何处理；槟榔提取液涂抹组：每日用消毒棉签蘸取槟榔提取液均匀涂抹大鼠上、下颚；机械刺激组：采用自制毛刷蘸取灭菌蒸馏水摩擦刺激大鼠上下颚，槟榔提取液涂抹+机械刺激组：遵以上方法进行提取液涂抹及机械刺激；造模时长共10周，造模结束后，自由饮食饲养恢复2周，总时长合计12周。造模结束后取口腔黏膜组织进行HE染色、Masson染色、免疫组化等指标。与传统方法相比，该方法稳定可靠，符合疾病发展的病理过程，可以更加全面模拟咀嚼槟榔对口腔粘膜纤维性变的影响。

技术领域

本发明涉及一种采用槟榔提取物与机械摩擦建立口腔粘膜纤维性变动物模型的建立方法，属于动物实验模型构建技术领域。

背景技术

口腔黏膜下纤维性变(OSF)是一种慢性，隐匿性疾病，是口腔癌发生的早期标志事件。口腔粘膜下胶原细胞异常沉积是OSF主要的病理特征，胶原沉积可导致患者口腔粘膜增生硬化，出现纤维状条索进而张口受限、运动困难，严重影响生活。OSF的发病与基因、免疫及生活习惯有密切关系，而咀嚼槟榔则是OSF发病的高危因素。咀嚼槟榔是东南亚及我国海南、湖南等地区的饮食习惯，而该类地区常为口腔癌及OSF高发地区。目前普遍认为，咀嚼槟榔与OSF发病直接相关，槟榔咀嚼人群中OSF发病率高达0.1％～3.4％，远高于其他人群。开发建立OSF动物模型对OSF发病机制的阐明及治疗策略的开发具有重要意义。

国内外多位学者开展了OSF动物模型的研究，使用槟榔碱、化学制剂等药物诱导，采用喂药，涂抹，注射等方式在实验动物颊部给药。然而，胶原细胞纤维增生是一类复杂的病理反应，受多种因素制约，槟榔作为加工食品，本身具有的纤维粗糙、成分复杂的特点，某一种或几种成分的对局部口腔黏膜的化学刺激难以对胶原纤维增生造成持续影响，现有模型无法准确、稳定复制与衡量槟榔咀嚼对黏膜胶原细胞的损伤，急需进一步完善造模方式。综合机械及化学方式刺激大鼠黏膜，可以更加全面模拟咀嚼槟榔对口腔粘膜下胶原细胞增生的影响。

发明内容

目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种采用槟榔提取物与机械摩擦建立口腔粘膜纤维性变动物模型的建立方法。

技术方案：

本发明的目的是提供一种口腔粘膜纤维性变动物模型的建立方法，采用该方法能够模拟槟榔引起口腔粘膜纤维性变。该复制方法稳定性、重复性较好，与发病病程相符合。

采用乙醇回流萃取法制备槟榔提取物，选取正常健康的SD大鼠作为模型动物，对照组：不作任何处理，正常饮水、饮食；槟榔提取液涂抹组：每日用消毒棉签蘸取槟榔提取液均匀涂抹大鼠上、下颚；机械刺激组：采用自制毛刷蘸取灭菌蒸馏水摩擦刺激大鼠上下颚，槟榔提取液涂抹+机械刺激组：遵以上方法进行提取液涂抹，同时遵以上方法进行机械刺激；造模时长共10周，造模结束后，大鼠不作任何处理，自由饮食饲养恢复2周，总时长合计12周。造模结束后取口腔黏膜组织进行HE染色、Masson染色、免疫组化等指标。

上述模型的建立具体包括以下步骤：

1.选取正常健康体重为200-300g的SD大鼠作为模型动物。

2.采用乙醇回流萃取法制备槟榔提取物，取市售槟榔原料粉碎后过筛，加适量乙醇溶液超声，随后进行乙醇回流萃取后过滤，乙醇提取物进一步浓缩挥干，得槟榔提取物。采用高效液相色谱法测定槟榔提取物中有效成分槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔次碱的含量。

3.槟榔提取物涂抹法：用消毒棉签蘸取槟榔提取液(含0.1g提取物)均匀涂抹大鼠上、下颚，涂抹后放回笼中，禁水禁食1小时。

4.机械刺激法：使用灭菌后的止血钳牵拉打开大鼠口腔，采用自制毛刷蘸取灭菌蒸馏水摩擦刺激大鼠上下颚不少于1min，随后放回笼中，正常饲养、饮食。