[发明专利]一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法

说明书

本发明公开一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法，将企剑白墨墨兰根状茎接种于芽分化培养基中进行培养，所述芽分化培养基中含有细胞分裂素6‑BA和催化生长素生物合成的类黄素单加氧酶专一性抑制剂Yucasin，促进了激素相关基因的表达并引起内源激素微环境的改变，从而促进企剑白墨墨兰根状茎芽分化，可直接用于企剑白墨墨兰种苗的工厂化生产，推动墨兰产业发展。

技术领域

本发明属于植物组织培养，具体地涉及一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法。

背景技术

中国兰，简称国兰(Chinese Cymbidium)，是指兰科兰属(Cymbidium)植物中的一部分地生种，包括春兰、墨兰、蕙兰、建兰、寒兰、春剑、莲瓣兰、豆瓣兰、送春等，具有极高的观赏价值、经济价值和文化价值。墨兰是国兰中最先被驯化、栽培最为广泛的种类之一。其中，‘企剑白墨墨兰’是墨兰四大传统品种之一，因其姿态秀美、芳香馥郁、花香幽远，深受达官贵人、文人雅士喜爱，是中国兰文化重要物质载体之一。随着中国日益强大，作为中国传统文化物质载体的国兰将具有更广阔的市场前景。

种苗工厂化繁殖是兰花产业的核心技术之一，直接影响兰花育种和种苗生产的效率。以大花蕙兰为代表的附生兰，中间繁殖体为类原球茎，易工厂化繁殖，早在上世纪60年代已形成‘兰花工业’；以国兰为代表的地生兰，中间繁殖体为根状茎，种苗工厂化繁殖难，导致目前国兰种苗生产仍然以分株繁殖为主，严重制约了国兰产业化发展。

兰花种苗工厂化生产可分为中间繁殖体诱导、增殖、芽分化、生根壮苗和试管苗移栽5个步骤。国兰组培快繁难的主要原因在于中间繁殖体根状茎难分化。如企剑白墨墨兰在组织培养过程中存在中间繁殖体根状茎分化难的问题，导致其工厂化繁殖效率低，无法满足商业化生产的要求。

发明内容

本发明的目的是为提高墨兰组织培养过程中苗分化的效率而提供一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法。

一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法，将企剑白墨墨兰根状茎接种于芽分化培养基中进行培养，所述芽分化培养基中含有6-BA和Yucasin。

所述的芽分化培养基包括以下组分：MS培养基+0.1～1.0mg/L 6-BA+30～100μmol/L Yucasin+25g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶，pH为5.4～5.8。

所述芽分化培养基配制方法为：将MS培养基、6-BA、蔗糖和卡拉胶混合并调节pH至5.4～5.8，经高压蒸汽灭菌，冷却，再加入经过滤灭菌的Yucasin。Yucasin为生长素吲哚乙酸(IAA)的生物合成吲哚丙酮酸(IPA)途径的关键酶——类黄素单加氧酶(YUCCA)专一抑制剂：5-(4-氯苯基)-2,4-二氢-[1,2,4]-三唑-3-硫酮，即5-(4Chlorophenyl)-2,4-dihydro-[1,2,4]-triazole-3-thione。

所述高压蒸汽灭菌的温度120～125℃，时间15～25min。

所述企剑白墨墨兰根状茎长度为1.0～1.5cm。

所述培养条件为：每天光照12～14小时，光照强度为1500～2000lux，培养温度为25～27℃的条件下培养，培养10～30天。与现有技术相比，本发明具有以下效果：

(1)芽分化是企剑白墨墨兰种苗工厂化繁殖的关键步骤，生长素和细胞分裂素在其中挥着关键作用。Yucasin是类黄素单加氧酶(YUCCA)专一性抑制剂，本发明在芽分化培养基中同时加入Yucasin和6-BA能显著促进企剑白墨墨兰根状茎激素相关基因YUCCA7,8、LAX2、PIN3、ABCB7,9、IAA3,4,6,9、GH3.4,6、ARF13、CRR2和LOG1的表达。