[发明专利]一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44b及其定点突变方法与应用

权利要求书

1.一种转录因子NtMYB44b在提高烟草抗旱能力上的应用，其特征在于，所述转录因子NtMYB44b的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，利用CRISPR/Cas9技术，特异性的在烟草转录因子NtMYB44b基因靠近TGA翻译终止密码子部位设计靶位点，造成NtMYB44b基因定点突变，获得的NtMYB44b基因纯合突变烟株比野生型烟株具有更好的抗旱能力。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，转录因子NtMYB44b编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，转录因子NtMYB44b的定点突变方法包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtMYB44b基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；

C、NtMYB44b基因的CRISPR/Cas9载体的构建：根据基因序列设计靶位点sgRNA序列，合成sgRNA引物序列，将sgRNA序列通过酶切和连接进pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；

D、NtMYB44b基因突变测序检测：根据NtMYB44b基因序列设计特异性检测引物，通过高保真DNA聚合酶扩增NtMYB44b的基因序列片段，通过Sanger测序方法测序PCR产物，与NtMYB44b基因序列进行比对，如果在靶位点sgRNA序列后出现双峰即为突变成功。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，B步骤中引物为：

正向引物 ：5’- ATGGCCAATGGCAGTAACTGTTC -3’

反向引物 ：5’- CTAATCGATTTTGCTTACTCCCATGCG -3’。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，C步骤中构建突变NtMYB44b基因的CRISPR/Cas9载体的靶位点sgRNA序列为：sgRNA序列：5’- TATGCAGATTCCGCCACCTC -3’。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，D步骤中检测NtMYB44b在靶位点后出现突变的特异性引物为：

正向引物：5’- CTTCTACAGCAGCTCGTTCATAA-3’

反向引物：5’- CACCTTATCTTGCTCTCCTCCT-3’。