[发明专利]一种抗肿瘤NK细胞及其制备方法

说明书

本发明通过CRISPR‑CAS9基因编辑技术使NK92恒定高表达细胞因子IL2与IL12，实验发现恒定高表达的IL2与IL12经过自分泌途径作用于NK92细胞自身及其它邻近细胞，明显提高NK92细胞的增殖能力与对K562肿瘤细胞的杀伤活性。由此，本发明成功研制能够持续增殖和抗肿瘤活性明显增强的新型高效的NK细胞。

技术领域

本发明属于医学免疫治疗领域，涉及可持续增殖的新型高效抗肿瘤NK细胞及其研制。

背景技术

目前，包括CAR-T、NK细胞和免疫检查点抑制剂等的肿瘤免疫治疗成为最有前景的肿瘤治疗方法。其中NK细胞具有强大的天然抗肿瘤，且无需肿瘤细胞抗原(靶点)预先致敏即可识别并攻击肿瘤细胞，回避了实体肿瘤细胞缺乏理想的靶点这个障碍。但瘤体组织内活化NK细胞数量少、活性低是针对实体肿瘤的NK细胞免疫治疗的疗效的主要障碍。

采用体外扩增方法获得高数量、高纯度NK细胞，是近年研究NK细胞过继免疫治疗的热点。随扩增方法进步，NK细胞活性、纯度提高，为NK细胞成为肿瘤过继免疫治疗提供重要平台。但是，过继输注的NK细胞只有很少部分透过毛细血管进入实体肿瘤微环境，接触并杀伤肿瘤细胞，并不能解决瘤体组织内活化NK细胞数量少这个问题。最近研究发现肿瘤可能导致NK细胞数量减少，即患者外周血中能刺激转化为NK细胞的效应细胞数量较少，同时功能有不同程度的损害，可能导致扩增出的自体NK细胞功能低下。

目前NK细胞过继免疫治疗分为两类：自体NK细胞治疗和异体NK细胞治疗。但是，NK细胞只能杀伤缺乏及配型不一致的HLA分子肿瘤细胞，对表达HLA分子的肿瘤细胞没有杀伤作用。如果患者肿瘤细胞表达HLA分子。那么NK细胞表面的抑制性受体将发挥主要作用，患者自体激活的NK细胞将不能起到杀伤作用。

许多学者试图建立应用异体NK细胞用于肿瘤生物治疗，NK-92是唯一进入临床研究的细胞系，其对不同来源肿瘤细胞系，如白血病、乳腺癌等都表现出高效的杀伤活性。其表面表达大量活化受体，如NKp30、NKp46、NKG2D、NKG2E；抑制受体的表达极少，缺乏大多数正常NK细胞克隆表达的KIRs，却保留穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒作用。I期临床试验研究表明，异体NK细胞治疗恶性肿瘤无毒副作用以及移植物抗宿主反应，提示NK细胞可能成为恶性肿瘤治疗的新路径。但是也存在着异体NK细胞在受者体内存活时间短、免疫排斥等问题。

研究表明，NK细胞可以通过直接的细胞毒作用以及与细胞因子相结合的方式来控制肿瘤的生长。为了克服肿瘤细胞对NK细胞介导的溶解性的抵抗，提高对肿瘤识别能力，嵌合受体被广泛研究；特异性的嵌合受体一旦接触抗原，嵌合受体信号即可激活NK细胞。

现有的使患者NK细胞增殖与活性增强的技术方案是：全身使用IL-2、IL-12等细胞因子，或转基因技术使局部某种细胞高表达这些细胞因子，从而使NK细胞增殖与活性增强。但全身使用的细胞因子作用于NK细胞的浓度并不高，且毒副反应大；转基因技术使局部某种细胞，如肿瘤细胞高表达这些细胞因子，缺点是细胞因子表达水平难以控制，直接作用于NK细胞的浓度也不高。更重要的是，细胞因子转基因修饰方式受到主要组织相容性复合基因MHC分子限制性的控制，使其应用受到限制。

本技术发明的NK细胞CRISPR-CAS9基因编辑技术等基因改造技术可克服这些局限性。

参考文献

D.SGOURAS,R.DUNCAN*.Methods for the evaluation ofbiocompatibility ofsoluble synthetic polymers which have potential for biomedical use:1-Use ofthe tetrazolium-based colorimetric assay(MTT)as a preliminary screen forevaluation of in vitro cytotoxicity.JOURNAL OF MATERIALS SCIENCE:MATERIALS INMEDICINE I(1990)61-68.