[发明专利]一种抗肿瘤NK细胞及其制备方法

权利要求书

1.一种遗传修饰的NK细胞的制备方法，所述制备方法为：通过基因工程手段，使NK细胞高表达IL2和IL12；

所述基因工程手段是通过转录激活型CRISPR-CAS9系统实现的；

所述CRISPR-CAS9系统中，针对IL2的sgRNA靶序列为：GGATCTCCTCAAGTGTCCCC，如SEQID NO.1所示；针对IL12 A 的sgRNA靶序列为： GCCGACGTTGCACCAGGTGC，如SEQ ID NO.3所示; 针对IL12 B 的sgRNA靶序列为：TCCTCGTTATTGATACACAC，如SEQ ID NO.5所示；其中IL12A指IL12的第一亚基，IL12B指IL12的第二亚基；

所述基因工程操作的步骤为：

（1）sgRNA载体的构建：构建慢病毒载体，所述慢病毒载体中包含所述针对IL2的sgRNA靶序列和所述针对IL12的sgRNA靶序列，其中，所述针对IL12的sgRNA靶序列包括所述针对IL12A的sgRNA靶序列和所述针对IL12B的sgRNA靶序列，其中，各个靶序列之间由2A基因间隔，2A基因序列为GGATCTGGCGCCACCAACTTCTCTCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCAGGCCCA；

（2）dCas9质粒的构建：合成dCas9质粒，所述dCas9质粒具有核定位信号，所述dCas9质粒的C-端具有VP64转录激活结构域，所述dCas9质粒具有D10A与H840A双突变，所述dCas9质粒无酶切活性；

（3）NK细胞的感染：用所述sgRNA载体和所述dCas9质粒转染293T细胞，制造慢病毒液，PEG8000浓缩后联合病毒原液感染NK细胞，得到所述遗传修饰的NK细胞。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述293T细胞的转染是通过脂质体介导的转染进行的，NK细胞的感染是通过慢病毒感染进行的。

3.一种遗传修饰的NK细胞，所述遗传修饰的NK细胞是通过如权利要求1或2所述的制备方法制备得到的所述遗传修饰的NK细胞。