[发明专利]一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法

说明书

本发明涉及一种甾体激素类代谢物的定性、定量分析方法。本发明基于组合衍生化和LC‑HRMS/MS的方法实现甾体激素类代谢物的定性分析；基于组合衍生化与2D LC‑MS/MS的方法实现甾体激素类代谢物的定量分析。本发明所述定性、定量分析时间短，分析物质多，检测灵敏度高，能够用于挖掘未知甾体激素。

技术领域

本发明涉及代谢物分析技术领域，具体涉及一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法。

背景技术

目前临床上测量激素物质的含量水平的分析方法依赖于免疫分析，即包括放射免疫分析法，通过放射性标记抗原与标准品抗原或样本中未被标记的抗原对限定的特异性抗体的竞争结合反应。或者非同位素标记的免疫分析技术，化学发光、电化学发光、酶放大化学发光、荧光免疫、金属免疫分析等。但这些方法具有不确定的特异性，而其对于一些化合物灵敏度也不符合要求，并且每一次测定需要用血200μL，只能得到单一物质的含量，对于结构较为相似的物质，并且在低浓度的范围内，缺乏分析精度，容易造成诊断错误，例如在儿科诊断的过程中，常由于分析物含量较低，无法提供诊断依据。或测量绝经前后期的女性睾酮含量时，免疫分析法无法测定睾酮的准确含量等，同时免疫分析测定时样本未经过一定步骤的前处理，导致测量值受到基质效应以及人为测定的影响较大，这种误差也无法通过内标进行校正。若生物样本的激素物质浓度超过检测试剂盒测量范围，便无法准确测定物质含量。

发明内容

本发明的解决的技术问题在于提供一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法。本发明所述分析时间短，分析物质多，检测灵敏度高，能够用于挖掘未知甾体激素。

为解决本发明的技术问题，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种甾体激素类代谢物的定性分析方法，包括以下步骤：

1)以水解酶对样品水解，利用反相碳18固相萃取96孔板(Waters Sep-Pak tC18100mg)提取水解后的样品中甾体激素，挥干后得待测样品；

2)采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对步骤1)得到的待测样品进行衍生化，得到未标记的衍生化样品；采用氘代吉拉德试剂P与氘代丹磺酰氯对待测样品进行衍生化标记，得到标记的衍生化样品；

3)将标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合，采用高分辨Q ExactiveOrbitrap型质谱，利用ddms2的数据采集模式，采集甾体激素的一级及二级质谱数据，利用MS-DIAL进行峰对齐、峰提取，筛选出含报告离子的母离子峰；

4)推算分子组成；

选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构，吉拉德试剂P结合物与氘代吉拉德试剂P结合物出峰时间在±0.2min内，且子离子裂解符合GP类甾体激素裂解规律的物质作为第一甾体激素待识别物，将所述第一甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第一甾体激素待识别物的分子组成；

选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与丹磺酰氯结合的基本结构，丹磺酰氯结合物与氘代丹磺酰氯结合物出峰时间在±0.4min内的物质作为第二甾体激素待识别物，将所述第二甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第二甾体激素待识别物的分子组成。

优选的是，步骤1)所述样品包括尿液、血液。

优选的是，步骤3)标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合体积比为1:1。

优选的是，步骤3)所述报告离子包括：吉拉德试剂P类衍生物的报告离子80.0495及85.0809；丹磺酰氯类衍生物的报告离子171.1043及177.1419。