[发明专利]一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法

权利要求书

1.一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法，包括以下步骤：

定性分析方法为：

(1.1)取500μL的尿液样本，加入500μL由醋酸钠配制好的β-葡萄糖醛酸酶解液，37℃下孵育一晚，用1mL甲醇、1mL纯水依次淋洗沃特世碳18固相萃取96孔板，后1mL尿液上样，用2mL甲醇洗脱，挥干溶液，得到待测样品；

(1.2)采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对步骤(1.1)得到的待测样品进行衍生化，得到未标记的衍生化样品，即为轻标；采用d5-吉拉德试剂P与d6-丹磺酰氯对待测样品进行衍生化标记，得到标记的衍生化样品，即为重标；

(1.3)将标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品按体积比1:1混合，进行LC-HRMS/MS分析：

采用高分辨QExactive Orbitrap型质谱，利用数据依赖性二级质谱扫描ddMS2的数据采集模式，采集甾体激素的一级及二级质谱数据，利用MS-DIAL进行峰对齐、峰提取，筛选出含报告离子的母离子峰；所述报告离子包括：吉拉德试剂P类衍生物的报告离子80.0495及85.0809；丹磺酰氯类衍生物的报告离子171.1043及177.1419；

选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构，吉拉德试剂P结合物与氘代吉拉德试剂P结合物出峰时间在±0.2min内，且子离子裂解符合吉拉德试剂P类甾体激素裂解规律的物质作为第一甾体激素待识别物；将所述第一甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第一甾体激素待识别物的分子组成；所述环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构包含：24个C原子、至少含有一个O原子、有且仅含有3个N原子；

选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与丹磺酰氯结合的基本结构，丹磺酰氯结合物与氘代丹磺酰氯结合物出峰时间在±0.4min内的物质作为第二甾体激素待识别物；将所述第二甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第二甾体激素待识别物的分子组成；所述环戊烷多氢菲与丹磺酰氯试剂结合的基本结构包含：29个C原子、至少含有三个O原子、有且仅含有1个N原子、S原子；

通过该定性方法共识别到50种甾体激素类代谢物，具体为：

对上述定性分析方法识别到的50种甾体激素类代谢物进行定量分析，具体分析方法为：

(2.1)以β-葡萄糖醛酸酶对尿液样品进行水解，利用沃特世碳18固相萃取96孔板提取水解后的样品中甾体激素，挥干溶液后得待测样品；

(2.2)采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对步骤(2.1)得到的待测样品分别进行衍生化，得到吉拉德试剂P类衍生化样品和丹磺酰氯类衍生化样品；

(2.3)将步骤(2.2)得到的吉拉德试剂P类衍生化样品和丹磺酰氯类衍生化样品进行二维液相分析；将两种衍生化反应后的衍生物上样于同一色谱柱，利用流动相除去过量的衍生化试剂，分析衍生化样品；

所述二维液相分析的两个色谱柱为安捷伦高分辨碳18色谱柱，所述色谱柱的尺寸为1.8μm，2.1mm×50mm；连接方式为平行柱分析；所述二维液相分析的流动相分别是：流动相A和流动相B；所述流动相A为含0.1％的甲酸和10mM的甲酸铵的水溶液，所述流动相B为含0.1％的甲酸和1mM的氟化铵的甲醇与乙腈体积比为1:1的混合溶液；

取10μL丹磺酰氯类衍生化样品，0～3min以100％的水相A为流动相以0.5mL/min的速度进行上样，流动相直接流进废液；接着取10μL吉拉德试剂P类衍生化样品，流速0.5mL/min，按照以下条件进行上样分析：

0～2min，流动相A的比例为85～78％；

2～4min，流动相A的比例为78～75％；

4～6min，流动相A的比例为75～70％；

6～7min，流动相A的比例为70～70％；

7～8min，流动相A的比例为70～65％；

8～10min，流动相A的比例为65～60％；

10～12min，流动相A的比例为60～60％；

12～12.1min，流动相A的比例为60～85％；

12.1～12.5min，流动相A的比例为85～85％；

12.5～12.6min，流动相A的比例为85～25％；

12.6～13min，流动相A的比例为25～25％；

13～17min，流动相A的比例为25～23％；

17～18min，流动相A的比例为23～20％；

18～19min，流动相A的比例为20～18％；

19～20min，流动相A的比例为18～16％；

20～20.5min，流动相A的比例为16～10％；

20.5～20.6min，流动相A的比例为10～100％；

20.6～21min，流动相A的比例为100～100％；

流动相开始运行梯度的最初1min，流动相直接进入废液；1min以后，流动相开始进质谱；

二维液相分析后，采用多反应监测的质谱采集模式对样品进行采集；所述质谱条件为：

将采集得到的数据进行定量分析，得到甾体激素类代谢物定量结果。