[发明专利]一种巯基功能化肽核酸增强银纳米簇荧光信号检测单核酸多态性的方法及其应用

说明书

本申请公开了一种巯基功能化肽核酸增强银纳米簇荧光信号检测单核酸多态性的方法，该方法包括以下步骤：1)获得N端巯基基团修饰的目标肽核酸探针；2)获得DNA为模板合成的银纳米簇探针；3)将所述目标肽核酸探针和银纳米簇探针混合得到第一混合溶液；将所述目标肽核酸探针与待测DNA片段进行杂交，然后与银纳米簇探针混合得到第二混合溶液；4)在相同条件下测定荧光光谱，分别获取第一混合溶液的第一光谱信息和第二混合溶液的第二光谱信息；对比第一光谱信息和第二光谱信息，鉴别碱基错配。该方法具有无标记、低成本且灵敏度高和选择性强的特点，可以通过简单地改变特异性肽核酸探针的序列来检测任何种类的基因突变。

技术领域

本发明属于化学和生物传感技术领域，具体涉及一种巯基功能化肽核酸增强银纳米簇荧光信号检测单核酸多态性的方法。

背景技术

在基因突变形式中，单核苷酸多态性(SNPs)是最常见的基因变异形式，与多种遗传性疾病、癌症和药物治疗等密切相关，因此，SNPs作为新一代生物标志物用于遗传病和癌症的预防、诊断和治疗得到了广泛的关注。现阶段常用SNPs基因分型检测方法包括等位基因特异性酶技术、等位基因特异性结合荧光技术等。等位基因特异性酶技术是一种基于引物特异性杂交或延伸和酶侵入性切割的方法，这种检测方法虽然在室温下也能提供较为灵敏和准确的检查，但通常需要复杂的步骤，测定的程序繁琐，检测中酶活性不稳定以及修饰引物价格昂贵等缺点。等位基因特异性结合荧光技术，如分子信标、二元探针、碱基区分荧光探针和立足介导的链置换反应，提供了一种新型的简单、直接和无酶参与的鉴定特定核酸序列的技术。然而，大多数这种类型的方法在室温下灵敏度低或特异性差，并且有效地鉴别SNPs通常需要使用专门的设备，训练有素的人员，精确的环境温度控制和严格的实验条件。因此，开发一种简单，快速、无标记、易于携带、能在室温条件下对SNPs进行灵敏度高和选择性强的基因分型和定量操作的生物传感器，以简化检测过程，降低检测费用，满足现场实际应用中的需求是极为重要的。

肽核酸(PNA)是DNA的非天然类似物，其中整个脱氧核糖磷酸二酯骨架已被电中性聚酰胺骨架取代，并且肽核酸优于标准核酸寡聚体的特性如下：肽核酸可以在低盐浓度下通过Watson-Crick碱基配对特异性地与带负电荷的DNA或RNA杂交；肽核酸和DNA或RNA复合物具有更高的热稳定性；肽核酸具有抵抗核酸酶和蛋白酶的降解，完全匹配的DNA/肽核酸双链体中的肽核酸可以有效地保护单链DNA(ssDNA)免受特异性核酸酶的切割；肽核酸还可以通过非共价或共价相互作用吸附在纳米材料上，构建灵敏的生物传感器，并且其优异的稳定性和特异性结合核酸的能力使PNA成为普通环境中诊断工具的出色候选者。

近年来以DNA为模板制备的银纳米团簇(DNA-AgNCs)具有高量子产率，强光稳定性和小尺寸等优势。模板DNA序列的变化，影响着合成出银纳米团簇的尺寸、电子和光学性质和组装行为，并且有时甚至赋予其新的功能，使得合成出的银纳米簇荧光发射光谱随之变化。其中，以dC12(即12个C的DNA模板)为模板合成的银纳米簇可以与巯基产生荧光响应，使得AgNCs的荧光大幅度增强。可能的两种解释如下：第一可能是AgNCs和硫醇化合物之间通过Ag-S键的形成使配体到金属中心产生电荷转移(LMNCT)，以及硫醇化合物中的其他富电子基团(-COOH，-NH₂)的影响，均有可能增强荧光信号；另一种可能的解释是由于添加硫醇化合物改变了dC12模板的微环境，使其形成更紧凑的dC12结构，为AgNCs提供更好地保护，从而最大限度地减少溶液对AgNCs的荧光猝灭，导致荧光增强。本发明在巯基肽核酸存在下，由于呈电中性的单链肽核酸吸附到AgNCs表面，以及巯基基团与AgNCs的荧光响应机制，双重作用诱导AgNCs的荧光强度显著增强。相反，巯基肽核酸与DNA双链则不会导致AgNCs的荧光增强效应。因此，巯基功能化肽核酸与AgNCs之间这种特殊的相互作用，具有无标记、低成本且灵敏度高的优点，该材料有望应用于化学生物传感和生物成像等领域，例如检测特定的基因突变，如TP53基因。