[发明专利]一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，其特征在于，所述结合垫上标记有时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG；所述样品垫上设置有加样孔；所述层析膜上设有检测线与质控线，其中检测线上喷涂有旋毛虫肌幼虫ES混合抗原，所述旋毛虫肌幼虫ES混合抗原由旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原与旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原按照1:1的质量比组成；所述质控线上喷涂有兔抗山羊IgG。

2.根据权利要求1所述的旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述样品垫材质为玻璃纤维素膜XQ-Y8；所述结合垫材质为玻璃纤维素膜Ahistrom8964；所述层析膜材质为硝酸纤维素膜Millipore135。

3.权利要求1所述的旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)旋毛虫肌幼虫ES混合抗原制备：将旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原及旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原，按照1:1的质量比混合，获得旋毛虫肌幼虫ES抗原；

2)结合垫的制备：将时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG喷涂在结合垫上，真空抽干后干燥保存备用；

3)检测线和质控线的制备：将旋毛虫肌幼虫ES混合抗原与兔抗山羊IgG按照1:0.625的质量比，分别喷涂在层析膜上，形成检测线与质控线，37℃干燥2-3h，使用封闭剂浸泡干燥后的层析膜1-2h，随后37℃干燥1-2h，密封保存备用；

4)试纸条的组装：在底板上沿样品检测时的层析方向依次将样品垫、结合垫、层析垫、吸水垫粘贴在底板上，制成试纸条。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原的制备方法如下：将旋毛虫肌幼虫用含有青霉素和链霉素的培养液洗涤后自然沉淀20-30min，然后将其放入含终浓度250U/mL青霉素和终浓度为250U/mL链霉素的培养液中，密度为3000-5000条/mL，37℃，10％二氧化碳，培养18-24h后收集上清，收集的上清依次经透析及3KDa超滤管浓缩后即为旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原的制备方法如下：将旋毛虫肌幼虫经口感染大鼠，剂量为8000条/只，6h后处死，取出大鼠小肠，切割成碎片，放置于含有培养液的培养皿筛网上，37℃孵育2-3h，收集培养皿底部的虫体，用含有青霉素和链霉素的培养液洗涤后自然沉淀20-30min，然后将其放入含终浓度250U/mL青霉素和终浓度为250U/mL链霉素的培养液中，密度为3000-5000条/mL，37℃，10％二氧化碳，培养18-24h后收集上清，收集的上清依次经经透析及3KDa超滤管浓缩后即为旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG的制备方法如下：每100μL 1％(w/v)的时间分辨荧光微球中加入0.05mol/L 2-吗啉乙磺酸MES溶液400μL，16mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS 50μL和8mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC 50μL混匀，室温孵育1-2h；反应结束离心后弃上清，使用磷酸盐缓冲液漂洗沉淀后加入500μL磷酸盐缓冲液重悬；

然后，加入40μL的5mg/mL山羊抗猪IgG，室温孵育1-2h；

然后，加入100μL的0.1mol/L甘氨酸溶液，室温孵育30-60min，离心后弃上清，向沉淀中加入8000μL偶联储存液重悬即得；所述偶联储存液为0.05mol/L PBS溶液，每升偶联储存液中含有Proclin300，0.5mL，BSA 10g，聚乙二醇400，20g。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述喷涂，点样速度为50μL/cm。