[发明专利]一种基于核酸内切酶的快速WGS建库方法

说明书

本发明公开了一种基于核酸内切酶的快速WGS建库方法。本发明提供了一种制备DNA文库的方法，依次包括如下步骤：(1)采用核酸内切酶进行打断；所述核酸内切酶具有在双链DNA上产生单链切口的活性；(2)同时采用Taq‑Klenow和DNA聚合酶进行末端补平和加A，同时利用DTT进行灭活前一步骤中加入的核酸内切酶；(3)完成步骤(2)后，不进行纯化，直接进行加接头。本发明中，实现一管内完成打断、补平、加dA和连接。从而实现简化和稳定的WGS(包括PCR‑free WGS)建库。

技术领域

本发明涉及一种基于核酸内切酶的快速WGS建库方法。

背景技术

现有技术中，全基因组测序(WGS)建库的第一步是打断，纯化，然后依次进行末端修复、加A、连接接头、PCR扩增。最常见的打断方式是物理打断以及酶打断。物理打断的方法主要包括超声或者声波共聚焦(Covaris)，需要特殊仪器，并且用时较长。Covaris并非各个分子生物学实验室都有，且使用相对复杂，打断需要时间较长。酶打断，最常见的是NEB的NEBNext DNA双链片段化酶或者Tn5，DNaseI也可以实现打断，但是活性难以控制，很少使用。

NEBNext DNA双链片段化酶是时间依赖型酶，能根据不同作用时间将dsDNA切割成50-1000bp片段。NEBNext DNA双链片段化酶由两种酶组成，一种酶随机的在dsDNA上产生切刻，另一种酶识别切刻处并在对链进行切割，产生dsDNA片段。所得DNA片段含有极短突出末端，5′含磷酸基，3′含羟基。经过文库制备及测序验证，NEBNext DNA双链片段化酶具有随机切割特性。但是这样产生的DNA片段内部仍会有很多单链缺口，后续加A会有潜在问题。

加A有两种酶：Taq DNA聚合酶或者Klenow Fragment(无核酸酶活性)。采用TaqDNA聚合酶进行加A会使单链缺口平移，这样就产生新的粘性末端，导致前一步进行的末端修复失效的潜在问题。Klenow Fragment(无核酸酶活性)有链置换(Strand-Displacement)活性，会产生单链DNA以及同样会使DNA片段进一步断裂。这样产生的片段不能进行连接。NEB的DNA双链片段化酶是同时加入了单链内切酶(突变型T7核酸内切酶I，但是比较贵，且有专利保护)，使单链缺口变成双链断裂。

Tn5建库是在一个反应中实现打断和连接。Tn5测序质量不如常规建库，因为两边的接头序列是固定的，而且成本会高一些，而且必须严格限制DNA投入量和Tn5的比例。如果想降低PCR循环数就必须增加DNA投入量，那么必须对应增加Tn5使用量，这样可能会使成本非常高。

发明内容

本发明提供了一种基于核酸内切酶的快速WGS建库方法。

本发明提供了一种制备DNA文库的方法，依次包括如下步骤：

(1)采用核酸内切酶进行打断；所述核酸内切酶具有在双链DNA上产生单链切口的活性；

(2)进行末端补平和加A；本步骤中同时采用Taq-Klenow和DNA聚合酶；所述DNA聚合酶满足如下两个条件：①不具有链置换活性和5’-3’外切酶活性；②具有3’-5’外切酶活性；

(3)完成步骤(2)后，不进行纯化，直接进行加接头。

所述核酸内切酶为DNA双链内切酶。具体的，所述核酸内切酶为NEBNext DNA双链片段化酶或嗜盐弧菌核酸酶。

示例性的，所述步骤(1)的反应体系可如表1所示。

示例性的，所述步骤(1)的反应条件可为：37℃，15分钟。

具体的，所述DNA聚合酶为T4DNA聚合酶。

步骤(2)的反应体系中，Taq-Klenow和DNA聚合酶的配比可为2.5U:4-8U，更具体可为2.5U:5-7U，更具体可为2.5U:6U。