[发明专利]一种超声辅助酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法

说明书

本发明公开了一种超声辅助酶法降解几丁质生产N‑乙酰氨基葡萄糖的方法，该方法包括如下步骤：（1）利用微生物发酵产几丁质酶，获得浓缩酶液；（2）称取几丁质粉末，依次加入纯水和磷酸缓冲液，再加入几丁质酶进行超声辅助酶解反应；（3）待反应结束后，向超声辅助酶解组中加入DNS，煮沸5min，测定还原糖含量。该方法的优点在于利用超声手段快速简单地获得大量的N‑乙酰氨基葡萄糖，相比未处理的酶解几丁质法，前者的效率更高，获得的最高转化效率是未处理的2.9倍。且该方法所用时间较短，耗材少，操作简单，酶解效率高，无化学污染，环境友好，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于N- 乙酰氨基葡萄糖的制备技术领域，具体涉及一种超声辅助酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

背景技术

几丁质（Chitin），也被称为甲壳素、甲壳质或壳多糖，主要存在于虾蟹贝类及昆虫等甲壳中，其中虾蟹壳中的含量最为丰富。该大分子是一种由单体N-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的多糖。通过化学酸碱法和生物酶法都可将其降解为几丁寡糖和单糖。但酸碱法对环境污染极大，且反应过程不易控制，反应效率低，得到的产品质量差，而生物酶法以其反应温和，便于控制，且环境友好等优点得以推广。

N-乙酰氨基葡萄糖作为几丁质的单体分子，近年来在医药、农业、化妆品行业及环境保护方面显示出广阔的前景。但由于几丁质的结晶度高，不溶于水的特性，使得生物酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的转化效率低，难以满足工业化的大规模生产。现已报道的高压均质法，研磨法，瞬间蒸汽爆破法等各方法由于高压，研磨效率低下，耗费时间过长，及高温危险性等存在不足。因此，找到一种简单有效的几丁质预处理方法，降低其结晶度，使其与几丁质酶结合更紧密，快速催化几丁质的水解，从而提高N-乙酰氨基葡萄糖的转化效率显得极为重要。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种超声辅助酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。超声辅助酶法降解几丁质的条件进行了优化，通过与未处理的普通酶解几丁质对比，极大程度提高了几丁质的降解效率，可获得大量的N-乙酰氨基葡萄糖。

一种超声辅助酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：

步骤1，微生物发酵产几丁质酶，并获得浓缩酶液

将Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1（ATCC BAA-2140^T） 菌株接种到种子液培养基中，37℃、200rpm 下培养 12 h，再以体积分数 5% 的接种量接入装有产酶发酵培养基摇瓶中，在温度为 26℃，转速为 200rpm，初始 pH7.5 下发酵 72 h 后收集发酵液；将获得的发酵液在4℃离心机中8000g离心，分离菌体，收集上清液，得到几丁质粗酶液；将粗酶液在旋转蒸发仪上抽真空浓缩，浓缩2-3h，得到原来0.3-0.6倍体积的浓缩酶液；

步骤2，超声辅助几丁质酶降解几丁质

称取0.005 g-0.03 g几丁质，依次加入1-5 mL纯水和缓冲液，然后向里面加入浓缩酶液，震荡均匀后在60%-100%功率的超声波清洗机中在37℃下超声0.5-3h；

步骤3，向反应体系中加入1-5 mL的DNS，沸水煮5min，冷却至室温，观察体系颜色变化情况，并离心后取上清液，在波长540nm下测吸光值即得还原糖的含量。

作为优选的是，所述的几丁质酶液产于菌株Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-H1 的保藏编号为CGMCC 3438 ^T，ATCC BAA-2140^T。