[发明专利]基于化学标记的修饰核苷的测序、富集和检测方法

说明书

本发明实施例的目的在于提供一种基于化学标记的修饰核苷的测序、富集和检测方法，其包括使巯基化合物与N‑羟甲基化学修饰核苷反应，再利用化学标记例如生物素进行标记，再富集并测序或检测本发明的方法采用选择性化学标记，化学反应的选择性保证了结果的特异性，减少了假阳性结果。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种基于化学标记的修饰核苷的测序、富集和检测方法。

背景技术

N⁶-甲基腺嘌呤(m⁶A)是真核生物信使RNA上含量最多的核酸修饰，具有动态可逆的特性，能调控特定转录本的代谢、翻译，从而影响癌症、免疫、神经发育等多种重要生物学过程。对m⁶A在全转录组水平进行测序能够给出其分布图谱，对其下游生物学功能研究具有重要意义。

目前对于核酸修饰的测序主要分为基于抗体和基于化学的两类方法。现有的m⁶A测序方法基于m⁶A抗体的免疫沉淀技术(MeRIP，Methylated RNA immunoprecipitation)。它利用m⁶A抗体从片段化的mRNA中富集出被甲基化修饰的RNA，用于构建文库和高通量测序，从而能够得到转录组上被甲基化修饰的区域。该技术被广泛应用于m⁶A的研究中，用来揭示多种生物学过程中这种RNA甲基化修饰的动态变化及其下游功能。除特定抗原分子之外，抗体还可能非特异性地识别其他结构类似的分子。例如m⁶A的抗体不仅能结合被甲基化修饰的腺苷，同样也能结合未被修饰的腺苷，还可能对含有特定二级结构的RNA具有偏好性。因此MeRIP-seq得到的片段除了含有m⁶A的RNA之外，还有一些不含m⁶A的RNA，这对测序结果和后续生物学分析会造成一定干扰。此外，抗体成本昂贵，不利于大规模实验的开展，阻碍了对m⁶A生物学功能的深入研究。

化学方法的优点是专一性高，而且由于用来富集的分子与核酸之间形成了共价键连接，相比抗体与核酸之间的非共价键富集效率也要高。用化学方法辅助修饰核酸测序的关键在于，找到一种只与特定修饰核酸发生反应，且不与其他核酸反应的分子，即寻找针对目标核酸“正交”类型的反应。而且，由于修饰核酸片段一般含量较低，反应效率也必须较高。另外，核酸难溶于有机相，反应还最好能在水相中发生。

FTO基因编码的FTO蛋白是一种Fe(II)和2-酮戊二酸依赖型的双加氧酶(Gerken等人，2007)，也是首个被报道的m⁶A的去甲基化酶(Jia等人，2011)。2012年，Fu和Jia揭示了FTO在去甲基化的过程中，有N⁶-羟甲基腺嘌呤(N⁶-hydroxymethyladenosine(hm⁶A))的中间体生成，同时，还有N⁶-甲酰基腺嘌呤(N⁶-formyladenosine(f⁶A))的f⁶A的中间体生成(Fu等人，2013)。FTO对m⁶A氧化过程中生成的hm⁶A和f⁶A在水溶液中都只能稳定存在一段时间，最终分别会自发脱去甲醛或甲酸变回A。

除了在FTO去甲基化的过程中由m⁶A生成(RNA上)以外，hm⁶A还可以由外源甲醛或者细胞内源性甲醛与腺嘌呤反应生成(RNA或DNA上)。据报道，在细胞内部有100-400μM的内源性甲醛(d'A，White，Casanova-Schmitz，1982；Tong等人，2013)，在某些肿瘤组织中甚至能达到1000μM(Tong等人，2010)，胞内相对恒定的甲醛浓度对于生命活动的正常进行具有重要作用。

发明内容

发明人首次发现巯基化合物能与hm⁶A发生特异性反应，hm⁶A是FTO酶促m⁶A去甲基化的中间体。基于上述发现，作出了本发明。