[发明专利]多元核酸检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种用于非疾病诊断目的的多元核酸检测方法，其特征在于，包括：

(1)设计DNA轨道，将不同的DNA轨道偶联到不同的荧光编码微球上，所述DNA轨道与对应的DNA步行者特异性杂交，不同的荧光编码微球具有不同的可识别荧光信号；

针对不同靶标核酸，设计与对应靶标序列特异性杂交的DNA步行者，所述DNA步行者的核酸二级结构为茎环结构，包括用于与靶标核酸互补杂交打开茎环结构的靶标识别区以及与对应DNA轨道杂交的DNA轨道识别区；

(2)以DNA步行者为模板、DNA轨道为引物进行DNA行走反应，待检测样本所含的靶标核酸能够触发荧光编码微球表面DNA行走；

(3)对荧光编码微球表面DNA行走产物进行荧光标记，该荧光标记与微球本身的荧光编码相区别；

(4)使用流式细胞仪对荧光编码微球进行荧光检测，获得样本中靶标核酸的含量。

2.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于DNA行走的核酸检测方法，其特征在于，靶标核酸为microRNA。

3.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的多元核酸检测方法，其特征在于，所述荧光编码微球的表面羧基化修饰，所述DNA轨道的5'端修饰氨基，所述DNA步行者的5'端修饰生物素，所述荧光标记的荧光基团为链霉亲和素修饰的荧光染料。

4.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的的多元核酸检测方法，其特征在于，不同荧光编码微球由两种荧光颜色不同荧光强度实现编码。

5.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的多元核酸检测方法，其特征在于，所述DNA行走反应的时间为30～50min，反应温度为55～60℃；所述荧光标记的反应时间为6～10min。

6.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的多元核酸检测方法，其特征在于，步骤(2)的反应体系包括：偶联DNA轨道的荧光编码微球，每种荧光编码微球1800～2000个；20nM相应的DNA步行者；0.1pM相应的miRNA；2微升扩增缓冲液；10mM Mg²⁺；10mM dNTPs；1U/μLBst DNA聚合酶；总体积为20微升。

7.一种多元核酸检测试剂盒，其特征在于，组成包括以下成分中的至少一种或几种：

DNA轨道，与对应的DNA步行者特异性杂交；

荧光编码微球，不同的荧光编码微球具有不同的可识别荧光信号；

DNA步行者，与对应靶标序列特异性杂交，所述DNA步行者的核酸二级结构为茎环结构，包括用于与靶标核酸互补杂交打开茎环结构的靶标识别区以及与对应DNA轨道杂交的DNA轨道识别区；

荧光素，用于对荧光编码微球表面DNA行走产物进行荧光标记。

8.根据权利要求7所述的多元核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括以下成分中的一种或几种：

扩增缓冲液、DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTPs、总miRNA提取试剂；

所述荧光编码微球的表面羧基化修饰，所述DNA轨道的5'端修饰氨基，所述DNA步行者的5'端修饰生物素，所述荧光素为链霉亲和素修饰的荧光染料，不同荧光编码微球由两种荧光颜色不同荧光强度实现编码。

9.根据权利要求7所述的多元核酸检测试剂盒，其特征在于，用于检测microRNA。

10.根据权利要求9所述的多元核酸检测试剂盒，其特征在于，DNA步行者的序列如SEQID NO.6～10所示中的一个或几个，DNA轨道的序列如SEQ ID NO.11～15所示中的一个或几个。