[发明专利]Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系及其制备方法、应用，重组蛋白表达系统

说明书

本发明涉及DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系及其制备方法、应用，重组蛋白表达系统，属于基因工程技术领域。本发明中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CHO细胞Dnmt3b基因，得到了Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系，该细胞系能够显著提高CHO细胞中目的基因的表达水平和表达稳定性，克服了目前CHO细胞表达系统存在的表达水平较低、表达不稳定的问题；在利用该细胞系表达重组阿达木单抗时，发现重组阿达木单抗的表达水平明显提高，因此该细胞系可以广泛用于目的蛋白的表达。

技术领域

本发明涉及Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系及其制备方法、应用，重组蛋白表达系统，属于基因工程技术领域。

背景技术

由于具有能够进行重组蛋白的装配和折叠以及翻译后修饰等突出特点，哺乳动物细胞特别是中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）细胞目前常被用于进行重组药物蛋白表达生产。但现阶段在重组CHO细胞长期培养生产中存在表达量较低、表达不稳定甚至表达量明显下降等现象。为此，在哺乳动物细胞中，如何提高表达量和表达稳定性已成为大规模生产重组蛋白亟待解决的主要问题。当前由于缺乏既能实现高产量又能稳定表达的重组CHO细胞系，重组蛋白的生产规模仍然受到极大限制。因此，采用分子克隆和基因工程的方法进行CHO细胞重组表达系统研究，对于提高重组蛋白的表达量和长期表达稳定性，进而建立高产稳产的重组CHO细胞表达系统具有十分重要的理论和实践意义。

造成这种重组蛋白产物表达不稳定性的确切机制尚未确切阐明。转基因表达减少的一个重要原因是持续表达过程中基因拷贝的逐渐丢失而导致转录本减少和转录沉默的发生。通过应用一些表观遗传调节的DNA顺式作用元件如核基质附着区序列（MAR）、普遍存在的染色质开放元件（UCOE）可以显著降低基因沉默以提高重组目的基因的表达。另外，转基因沉默还与生产过程中重组蛋白表达载体上驱动基因表达的启动子CpG位点的甲基化密切相关。如研究发现在单克隆抗体生产表达不稳定的重组CHO细胞中，人巨细胞病毒主要即时早期（hCMV-MIE）启动子的甲基化水平是增加的；利用5-Aza-2-脱氧胞苷（一种DNA甲基化抑制剂）处理这些表达降低的细胞可以部分恢复其单克隆抗体的产率。这表明，表观遗传因素如DNA甲基化在调节基因表达中起重要作用，启动子区域DNA的甲基化异常增加可能是导致重组CHO细胞中目的基因表达下降的重要因素。

DNA甲基化（DNA methylation）是一种在原核和真核生物基因组中常见的表观遗传修饰方式，也是哺乳动物中基因表达的重要调控方式，在基因转录抑制方面起关键作用。目前关于DNA甲基化对CHO细胞转基因表达影响的研究主要集中在启动子的修饰改造上，例如在启动子区域突变胞嘧啶、使用无CpG的或合成的启动子、或将核心CpG岛元件插入启动子。尽管这些经过改造的无CpG二核苷酸的启动子可减少早期的基因沉默，但仍然不能显著改善重组CHO细胞的长期表达稳定性。DNA甲基化主要由DNA甲基转移酶包括从头甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b以及DNA甲基化维持酶Dnmt1催化完成。特别是Dnmt3a和3b介导的启动子甲基化与转基因的不稳定表达密切相关，这提示二者在调控基因表达稳定性方面起重要作用。

公开号为CN107828738A的中国发明专利申请中公开了一种DNA甲基转移酶缺陷型CHO细胞系，该细胞系能够明显提高重组蛋白EPO的表达水平、同时克服重组蛋白表达不稳定的问题，很大程度提高了重组蛋白表达稳定性。但是在进一步利用该系统进行表达稳定性验证时，发现该系统还存在目的蛋白表达稳定性效果不理想、启动子DNA甲基化仍在一定程度发生的问题；按照生产中长期表达不加压筛选的要求，在无G418筛选压力时，传代30次后重组蛋白的表达维持率尚未达到70%，表达量仍然偏低。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系，该细胞系中缺失的DNA甲基转移酶Dnmt3b介导的表观遗传修饰与基因的表达调控关系更加密切，在没有筛选压力时，外源蛋白的表达更稳定，表达量也明显提高。