[发明专利]Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系及其制备方法、应用，重组蛋白表达系统

权利要求书

1.一种DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系，其特征在于：所述CHO细胞系中的Dnmt3b基因功能丧失，所述Dnmt3b基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系，其特征在于：CHO细胞系选自CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44中的任意一种。

3.如权利要求1所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CHO细胞中的Dnmt3b基因，即得。

4.根据权利要求3所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）确定打靶位点：根据Dnmt3b基因序列设计两个打靶位点sgRNA序列；

2）sgRNA载体的构建：将步骤1）设计的sgRNA序列添加粘性末端并合成2对4条引物，将配对的引物退火获得对应的带有粘性末端的双链DNA片段，将双链DNA片段分别连接到两个带有不同荧光报告基因CRISPR/Cas9系统表达载体中，获得两个CRISPR/Cas9-sgRNA载体；

3）将两个CRISPR/Cas9-sgRNA载体共同转染至CHO细胞中；流式分选挑选包含两种荧光报告基因信号的单克隆细胞进行培养，经过细胞敲除验证，即得。

5.根据权利要求4所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述两个打靶位点sgRNA序列分别为：

D3b-Ex1-31fw：5'-GAGGAATGTCTCATCGTCAATGG-3'；

D3b-Ex1-105fw：5'-CTTGGAGGCAATGTGCACAGAGG-3'。

6.根据权利要求5所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，其特征在于：步骤2）中设计的4条引物分别为：

D3b-Ex1-31fw-1：5'-CACCGAGGAATGTCTCATCGTCAATGG-3'；

D3b-Ex1-31fw-2：5'-AAACCCATTGACGATGAGACATTCCTC-3'；

D3b-Ex1-105fw-3：5'--CACCGCTTGGAGGCAATGTGCACAGAGG-3'；

D3b-Ex1-105fw-4：5'-AAACCCTCTGTGCACATTGCCTCCAAGC-3'。

7.根据权利要求5所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，其特征在于：步骤3）中细胞敲除验证时，所使用的引物为：

Dnmt3b-Ex1PCR-L：5'-GTGCCCCCATTTCTCCTACT-3'；

Dnmt3b-Ex1PCR-R：5'-AGACCCAATGTGCTGGTCTC-3'。

8.如权利要求1所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系在制备目的蛋白等方面的应用。

9.重组蛋白表达系统，其特征在于：其由包括如下步骤的方法制得：将目的基因插入表达载体中，构建得到重组蛋白表达载体；将该重组蛋白表达载体转染至如权利要求1所述的Dnmt3b缺陷型的CHO细胞系，经筛选得到重组CHO细胞表达系统，所述重组CHO细胞表达系统能够表达目的蛋白。

10.根据权利要求9所述的重组蛋白表达系统，其特征在于：所述目的蛋白为重组阿达木单抗。