[发明专利]一种快速高效的楸遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种快速高效的楸遗传转化方法。本方法利用楸子叶为外植体诱导胚性愈伤组织，然后进行农杆菌介导的遗传转化，主要步骤：遗传转化受体的获得与增殖，包括子叶愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的诱导和增殖；携带目的基因的农杆菌的制备；胚性愈伤组织的遗传转化；植株再生及生根；再生植株检测；转基因植株炼苗及移栽。采用本发明的方法对楸进行遗传转化，80‑100天获得阳性转化植株，转化效率92.23%‑97.14%。本发明周期短、操作简单、遗传转化效率高，为楸基因功能验证及分子育种提供了重要的技术支撑，加快了楸新品种的培育进程。

技术领域

本发明属于植物的遗传转化体系的构建方法领域，涉及一种快速高效的楸遗传转化方法。

背景技术

楸（Catalpa bungei）是紫葳科（Bignoniaceae）梓属（Catalpa Scop.）的珍贵的木材树种，且在园林观赏、生态防护、城市绿化等方面均有重要作用，自古以来就有“木王”美誉，具有非常高的科学价值和开发利用价值。

楸适应能力极强，生长迅速，分布于我国东起海滨，西至甘肃，南始云南，北到长城的广大区域，是可以大面积栽培的珍贵优质树种。然而，近年来楸病虫害严重，限制了其推广进程。因此，提高楸的抗病虫性，培育抗病虫优质楸新品种是目前迫切需要解决的主要问题。

自然状态下，楸树自交不亲和，不结实或结实率低，繁育多通过扦插和嫁接的方式，技术环节多，育苗周期长。长期的无性繁殖导致品种、类型和无性系单一化，加之过度的开发利用，造成楸资源匮乏。另外，楸的遗传改良主要是通过杂交育种的方式进行，但常规育种周期漫长，品种改良受到限制。利用现代分子生物学和基因工程技术，将目标基因整合到楸基因组中，获得相应的性状，快速、高效、目的性强，极大加快了育种的速度、提高了育种的效率，是解决抗病虫楸树新品种培育的有效手段。近几年来，有关楸树组织培养技术的研究开展较多，如杨燕等人发表于《林业科技开发》的“楸树腋芽增殖快繁技术研究”；韩创举等人发表于《西北林学院学报》的“楸树组培技术研究”；中国发明专利CN104054580A“一种提高楸树增殖系数的组织培养方法”等等。然而，目前，关于楸遗传转化的研究少有报道，仅中国发明专利CN107058374A “一种楸树遗转化体系的构建方法”，与之相比，本发明无需超声波处理辅助侵染转化既已达到92.23%-97.14%的高效转化率，且操作简单，周期短。

发明内容

本发明提供了一种快速高效的楸遗传转化方法，利用楸子叶为外植体诱导胚性愈伤组织发生，进而进行农杆菌介导的遗传转化和植株再生，为楸树利用转基因技术培育抗病虫的新品种提供一个成熟的技术途径，以期达到加快楸分子育种进程和生产转基因植株的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

1. 遗传转化受体的获得与增殖：

a) 子叶愈伤组织的诱导：成熟的楸种子经75%酒精表面灭菌60 s，无菌水冲洗2次，再浸泡于0.1%氯化汞溶液18 min，无菌水冲洗5次后平铺于愈伤诱导培养基上，25-28℃，暗培养20 d，获得愈伤组织；

b) 胚性愈伤组织的诱导：将诱导出的黄绿色子叶愈伤组织转置于胚性愈伤组织诱导培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代，直至产生胚性愈伤组织；

c) 胚性愈伤组织的增殖：将诱导出的胚性愈伤组织转置于胚性愈伤组织增殖培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代，使胚性愈伤增殖，以满足后续的遗传转化需求；

2. 携带目的基因的农杆菌的制备：将含有目的基因的植物表达载体通过冻融法导入农杆菌感受态中，挑取单克隆，目的基因PCR检测确定阳性单克隆后，过夜摇菌，收集菌体，由重悬液MS₀ (l)重悬；