[发明专利]一种快速高效的楸遗传转化方法

权利要求书

1.一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 遗传转化受体的获得与增殖：

a) 子叶愈伤组织的诱导：成熟的楸种子经75%酒精表面灭菌60 s，无菌水冲洗2次，再浸泡于0.1%氯化汞溶液18 min，无菌水冲洗5次后平铺于愈伤诱导培养基上，25-28℃，暗培养20 d，获得愈伤组织；

b) 胚性愈伤组织的诱导：将诱导出的黄绿色子叶愈伤组织转置于胚性愈伤组织诱导培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代，直至产生胚性愈伤组织；

c) 胚性愈伤组织的增殖：将诱导出的胚性愈伤组织转置于胚性愈伤组织增殖培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代，使胚性愈伤增殖，以满足后续的遗传转化需求；

(2) 携带目的基因的农杆菌的制备：将含有目的基因的植物表达载体通过冻融法导入农杆菌感受态中，挑取单克隆，目的基因PCR检测确定阳性单克隆后，过夜摇菌，收集菌体，由重悬液重悬；所述农杆菌采用农杆菌EHA105，农杆菌重悬液浓度OD600=0.60-0.65；所述重悬液是MS + 蔗糖30 g/L；

(3) 胚性愈伤组织的遗传转化：将增殖的胚性愈伤组织接入重悬的农杆菌菌液中，菌液完全浸没胚性愈伤组织，100 rpm，20 min，吸水纸吸干胚性愈伤组织表面的菌液后，平铺于共培养培养基，25-28℃，暗培养48 h；所述共培养培养基是MS + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L；

(4) 植株再生及生根：将共培养后的胚性愈伤组织转置于含150 mg/L Kan的分化培养基上，并将其堆积为大小合适的愈伤堆，进行转化子的选择培养，25-28℃，光强1500lx，12h/d的光下培养；20 d后，将存活的抗性胚性愈伤组织转置于含100 mg/L Kan的分化培养基上，培养20 d后，再将存活的抗性胚性愈伤组织转置于含50 mg/L Kan的分化培养基上，逐级筛选；2-3个月即可获得再生苗，再生苗株高2.5-4 cm转置于生根培养基中进行生根培养；

(5) 再生植株检测：对步骤(4)中的抗性再生植株幼苗进行报告基因的表达检测，同时，取再生植株的叶片，提取DNA，进行目的基因的PCR检测；

(6) 转基因植株炼苗及移栽：将根系健壮的转基因阳性苗的瓶盖拧开后放置7d炼苗，然后取出阳性苗，洗净根上滞留的培养基后移入装有营养土的花盆中并放置在保温棚中，一周后移出；所述营养土为泥炭土与珍珠岩以3:2混合。

2.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：所有培养基均调节pH值到5.8-6.0。

3.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：愈伤诱导培养基是MS + 6-BA (6-Benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤) 0.5 mg/L + NAA (1-Naphthylacetic aci，萘乙酸) 0.2 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。

4.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：胚性愈伤组织诱导培养基是DKW + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。

5.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：胚性愈伤组织增殖培养基是MS + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L+ 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。

6.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：添加抗生素的分化培养基是DKW + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L + ZT (Zeatin，玉米素) 0.2 mg/L +蔗糖30 g/L + 50-150 mg/L Kan (Kanamycin，卡那霉素) + 琼脂3 g/L；转化胚性愈伤组织初次转置于含150 mg/L Kan的分化培养基，20 d后继代，转置于含100 mg/L Kan的分化培养基，20 d后，转置于含50 mg/L Kan的分化培养基。