[发明专利]一种磁珠-PNA探针复合物及富集肝癌循环肿瘤DNA的应用

说明书

本发明公开了一种磁珠‑PNA探针复合物及富集肝癌循环肿瘤DNA的应用，将待测样本与磁珠‑PNA探针复合物杂交反应使待测样本中未突变基因与磁珠‑PNA探针复合物结合形成靶DNA‑磁珠‑PNA探针复合物，磁分离，获得含突变基因的上清；PCR无差别扩增含突变基因的上清后构建突变基因文库并采用分选磁珠纯化突变基因文库，再与捕获探针杂交反应，杂交产物加入捕获磁珠，使突变基因结合到捕获磁珠中，经过洗脱分离，获得肝癌循环肿瘤DNA。本发明较未经磁珠‑PNA探针复合物处理组在肝癌循环肿瘤DNA的检测灵敏度上提高了10倍以上。

(一)技术领域

本发明涉及一种富集肝癌循环肿瘤DNA中P53基因突变的方法。

(二)背景技术

肝癌是我国第二大癌症死因，目前肝癌的早期诊疗薄弱，缺乏准确和灵敏的预警和早诊标志物，该状况导致超过60％的肝癌患者在初次就诊时就已进入中晚期，从而失去手术根治的机会。更为严峻的是，对肝癌而言即使早期癌灶也可有高转移潜能，其高复发率与肿瘤大小、生物学特性、侧枝循环及栓塞技术、栓塞方式和程度等有关(尤其对于巨块型肝癌，周围常伴有影像学难以显示的微卫星灶及微血管侵犯，导致临床上所谓的“肝癌根治性手术”本质上却属于姑息性切除，术后的残癌细胞可获得转移潜能，引起复发、局部转移或远隔器官转移)。为尽可能早期发现残癌或复发，为患者争取适宜的、有效的治疗时机，需要能精确监测肿瘤进展的有效的手段，这也是当前国内外学者研究的主要方向。

循环肿瘤DNA检测技术近年来正逐渐成为国际上具重大潜力的肿瘤诊断新技术。据估算，目前影像学检测肿瘤的最小阈值为10亿个癌细胞，而外周血中循环肿瘤DNA的检测下限则为1千万个癌细胞，灵敏度提高了100倍[Regalado A.Spotting cancer in a vialof blood.MIT Technology Review.2014.]。对于其他常见肿瘤，当前针对肝癌循环肿瘤DNA检测技术的开发还很欠缺，面临着至少两个关键障碍：(1)肝癌循环肿瘤DNA在血液中的浓度极低，并有其它更高浓度的循环DNA的干扰；(2)肝癌基因变异(包括点突变、删除、插入、扩增、DNA修饰等)信息复杂而目前已知的信息不全面，检测的灵敏度及准确率限制了循环肿瘤DNA诊断肝癌的可行性[JiaCheng Tang,YiLi Feng,Tao Guo,AnYong Xie,XiuJunCai.Circulating tumor DNA in hepatocellular carcinoma:Trends andChallenges.Cell Biosci.2016；6:32.]。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种磁珠-PNA探针复合物及在富集肝癌循环肿瘤DNA中的应用，该方法可明显提高含P53 747GT突变的循环肿瘤DNA含量(富集效果在10倍以上)，克服了目前高通量测序平台因自身仪器错误率在检测突变丰度上的技术瓶颈，同时有效降低测序深度，节约了测序成本，使循环肿瘤DNA中P53基因(747GT)突变检测有望成为肝癌患者的预警、预防、早诊及预后监测的辅助指标，并为其治疗过程中靶向药物选择及耐药性进化等研究提供可能的借鉴。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种磁珠-PNA探针复合物，所述复合物是由磁珠与PNA探针结合而成，所述磁珠包被链霉亲和素；所述PNA探针的核苷酸序列为：5’-AAC CGG AGG CCC ATC CT-3’，在5’端进行生物素标记。所述PNA探针是以P53基因为模板设计。

进一步，所述磁珠以10mg/ml磁珠缓冲液悬液的形式加入，磁珠粒径为1.05μm。