[发明专利]一种磁珠-PNA探针复合物及富集肝癌循环肿瘤DNA的应用

权利要求书

1.一种磁珠-PNA探针复合物在富集肝癌循环肿瘤DNA中的应用，其特征在于所述应用的方法为：将待测样本与磁珠-PNA探针复合物杂交反应使待测样本中未突变基因与磁珠-PNA探针复合物结合形成靶DNA-磁珠-PNA探针复合物，磁分离，获得含突变基因的上清；PCR无差别扩增含突变基因的上清后构建突变基因文库并采用分选磁珠纯化突变基因文库，再与捕获探针杂交反应，杂交产物加入捕获磁珠中，使突变基因结合到捕获磁珠中，经过洗脱分离，获得突变基因，即肝癌循环肿瘤DNA；所述捕获探针核苷酸序列为：5’-AAC CGG AGTCCC ATC CT-3’；所述磁珠-PNA探针复合物是由磁珠与PNA探针结合而成，所述磁珠包被链霉亲和素；所述PNA探针的核苷酸序列为：5’-AAC CGG AGG CCC ATC CT-3’，在5’端进行生物素标记。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述磁珠以10mg/ml磁珠缓冲液悬液的形式加入。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述磁珠缓冲液悬液按如下方法制备：将包被链霉亲和素的磁珠以2×BW缓冲液重悬，即为磁珠缓冲液悬液；所述重悬用2×BW缓冲液体积以磁珠重量计为50μl/0.5mg；所述2×BW缓冲液组成为：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2MNaCl，溶解于超纯水，pH＝7.5。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述磁珠-PNA探针复合物按如下方法制备：取PNA探针水溶液于99℃变性10分钟，4℃静置5分钟后，与磁珠缓冲液悬液混合，室温杂交15分钟，置磁分离架上静置3分钟，弃上清，磁珠用1×BW缓冲液洗涤以除去未结合的探针，即得到磁珠-PNA探针复合物；所述PNA探针水溶液与磁珠缓冲液悬液体积比为1:1，所述PNA探针水溶液是将PNA探针用超纯水制成20pmol/ul的PNA探针水溶液；所述磁珠缓冲液悬液中磁珠包被有链霉亲和素，所述磁珠含量为10mg/ml。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：(1)复合物靶向结合未突变基因：将待测样本于99℃变性10分钟，4℃静置5分钟后，加入磁珠-PNA探针复合物和杂交液构成反应体系，50℃杂交1小时后，静置磁分离2分钟，获得靶DNA-磁珠-PNA探针复合物和含突变基因的上清，实现非突变基因的捕获；所述待测样本与磁珠-PNA探针复合物体积比为1:1；所述杂交液补足至反应体系100μL；所述杂交液组成：150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，0.02％Tween-20，溶解于超纯水，pH＝7.0；

(2)突变基因文库的构建：以步骤(1)中含突变基因的上清为模板，以P53-F和P53-R为引物进行PCR反应，并采用全能型DNA建库试剂盒将PCR产物建库，获得突变基因文库；

P53-F：TTTTCGACATAGTGTGGT；

P53-R：GTCCCAGTAGATTACCACT；

(3)突变基因的捕获：将步骤(2)突变基因文库经分选磁珠纯化后，加入捕获探针，涡旋震荡混匀后于杂交炉中95℃孵育5分钟，再于47℃孵育16至20小时，利用寡核苷酸分子杂交技术获得杂交产物；将杂交产物利用捕获磁珠捕获突变基因，纯化，获得突变基因，即肝癌循环肿瘤DNA；所述捕获探针核苷酸序列为：5’-AAC CGG AGT CCC ATC CT-3’。