[发明专利]狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法。该方法，包括：首先用SDS‑PAGE法和TEM法对目标峰定性鉴定；然后用蛋白定量试剂盒测定标准品的浓度；将此标准品进行系列稀释，用凝胶色谱柱在色谱仪上检测标准品在280nm处的吸收峰，建立浓度和峰面积的线性回归方程；根据线性回归方程和待测样品的峰面积计算得到待测样品中的狂犬病毒灭活抗原浓度。本发明的方法可用于狂犬病毒生产的质量控制，具有快速、稳定、重复性好的优点，可指导疫苗的生产，对提高疫苗品质起到重要作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及病毒的定量检测方法，具体涉及狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法。

背景技术

狂犬病毒由弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)引起的一种人畜共患、急性、高度致死性的传染病。根据对狂犬病毒N蛋白单克隆抗体以及G蛋白系列的分析和鉴定，全球各地的狂犬病毒主要分成4个血清型。其中血清1型即为人们所熟知的地理分布最广、对世界人民健康威胁最大的狂犬病毒，包括野病毒和固定毒实验室株(如SAD)。随着现代分子生物学的研究进展，参照狂犬病毒核蛋白(N protein)基因N端500个核苷酸的相似率，狂犬病毒属被分成7种基因型，基因型2～6只在欧洲和非洲发现。RABV呈典型的子弹状，其长度大约180nm，直径75nm。狂犬病毒颗粒包括核衣壳和外壳两部分，将其进行免疫染色后在电子显微镜下观察可发现其表面有子弹状突起物，同时也可观察到狂犬病毒内部存在一系列的似蜂窝状结构的条纹。狂犬病毒为不分节段的单股负链RNA病毒，其基因组总长度约1,2000nt，主要编码五种已知的结构蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA多聚酶(L)。上述编码五种结构蛋白基因在病毒RNA基因组中从3’到5’依次为N、P、M、G、L，其中在N基因前存在一段长度为56nt或58nt的Leader RNA序列，在G和L基因之间存在423nt的假基因(ψ)序列。其中，N，P，L形成高度螺旋的核糖核蛋白复合体(RNP)，在病毒复制、转录及诱导细胞免疫和体液免疫方面发挥关键作用，RNP被M蛋白和G蛋白构成的病毒衣壳包裹成完成的病毒粒子。狂犬病毒因其高致病性，一直以来，对狂犬病毒的评价主要是NIH法，即免疫小鼠后，产生相应的抗体，通过小鼠抗体水平的变化测定供试品的免疫原性。该方法耗时长、操作复杂，需用参考疫苗进行对照，且对试验人员有一定的安全隐患，不适宜用于疫苗生产的质量控制。

狂犬病毒分子量大，约为475000KD，目前狂犬病毒检测方法主要以抗体检测试剂盒测定狂犬抗体为主。对狂犬抗原的检测方法较少，主要有核酸检测、酶联免疫两种方法。狂犬病免疫荧光抗原检测试剂盒、狂犬病病毒巢式RT-PCR检测试剂盒这两种试剂盒都基于核酸检测，而且核酸到蛋白质涉及转录后翻译过程，与实际病毒蛋白的含量不一定呈正比，因此核酸检测法仅是对实际抗原含量的间接反映。基于核酸检测的方法，需要保持环境的严格控制，否则核酸的气溶胶污染很容易造成检测结果的假阳性，且很难在短时间内完全清除核酸的气溶胶污染，对试验环境要求较高。另外有狂犬病疫苗抗原测定试剂盒，是基于酶联免疫法，将已知狂犬病抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行，然后进行抗原的定量，该方法需要制备抗体，其对不同狂犬病毒株的特异性反应存在差别。

高效液相色谱法(HPLC)是一种操作简单、高效和灵敏度高的分析方法，分析速度快。凝胶色谱柱分离的原理是根据物质分子量的大小在凝胶色谱柱上实现分离，是一种高效的分子筛效应，分离过程中不会对样品造成损害。该法区别于其他方法的最优处在于是对病毒粒子进行检测，直接反映样品的真实状态。并且检测过程可视化，即病毒粒子的色谱吸收峰直观地呈现在色谱图上，配备的紫外检测器可通过色谱峰积分面积的大小就可直观反映出不同灭活抗原的病毒含量高低。样品无需特别处理，检测时间短，半小时内就可出结果。操作简单，属仪器分析法，人为操作的失误极小，重复进样的相对标准偏差一般小于2％，重复性非常好。非常适宜进行中间质控和成品检测。因此，利用HPLC检测技术进行狂犬病毒的定量分析，不仅能缩短传统的ELISA法的检测时间，还能提高检测稳定性，有利于狂犬病抗原生产的质量控制，进而起到提升狂犬病疫苗产品品质的作用。

发明内容