[发明专利]交替培养模式同步提高微藻叶黄素和蛋白质产量的方法

说明书

本发明涉及一种采用兼养‑自养交替培养模式同步提高微藻叶黄素和蛋白质产量的方法，包括以下步骤：先将藻种接种于种子培养基培养成种子液，再接种于装有发酵培养基的光生物反应器中培养；待发酵培养基中初始氮源浓度降至5~15 mg/L时，开始脉冲流加发酵培养基浓缩液；同时待初始乙酸钠浓度耗尽时，每间隔6‑48 h，向培养液中脉冲流加乙酸钠，使得培养液中的乙酸钠浓度达到0.5‑2 g/L，从而让藻细胞不断处于兼养‑自养交替状态，发酵周期3~9天。采用本发明方法有利于同步提高微藻叶黄素含量和蛋白质含量，且发酵周期短，生产工艺简单，生产成本低，能够显著提高采用微藻同时生产叶黄素和蛋白质的工业化前景。

技术领域

本发明涉及一种兼养-自养交替培养微藻的发酵工艺，具体涉及一种采用兼养-自养交替培养模式同步提高微藻叶黄素和蛋白质产量的方法。

背景技术

叶黄素是一种含氧的类胡萝卜素，由于具有较强的抗氧化和抗炎作用，被广泛应用于食品、饲料添加剂、医药和保健品等行业，而微藻则被认为是商业叶黄素的新兴来源（Lin, J.H., Lee, D.J., Chang, J.S., 2015. Lutein production from biomass:Marigold flowers versus microalgae. Bioresour. Technol. 184, 421-428）。

目前用于微藻叶黄素生产的培养方式主要有自养、异养和兼养。微藻采用自养模式较为普遍，可将光能和无机养分（如二氧化碳、硝酸盐、磷酸盐等）转化为微藻生物质，进而生产叶黄素（Xie, Y., Ho, S.H., Chen, C.N.N., Chen, C.Y., Ng, I.S., Jing, K.,Chang, J.S., Lu, Y., 2013. Phototrophic cultivation of a thermo-tolerantDesmodesmus sp. for lutein production: Effects of nitrate concentration,light intensity and fed-batch operation. Bioresour. Technol. 144, 435-444）。由于叶黄素在光合作用过程中起到重要作用，叶黄素的积累与光照条件密切相关（Vaquero,I., Mogedas, B., Ruiz-Dominguez, M.C., Vega, J.M., Vilchez, C., 2014. Light-mediated lutein enrichment of an acid environment microalga. Algal Res. 6,70-77），因此自养培养可获得较高的叶黄素含量。然而，在这种培养模式下微藻的生长速度相对较慢，在一定程度上限制了其商业化开发。另一方面，一些微藻可利用有机碳源在无光照的情况下进行异养生长，从而获得较快的细胞生长速度及更高的生物量（Perez-Garcia,O., Escalante, F.M., de-Bashan, L.E., Bashan, Y., 2011. Heterotrophiccultures of microalgae: metabolism and potential products. Water Res. 45(1),11-36），但无光条件也会导致叶黄素含量普遍较低。而微藻在兼养培养过程中，既需要有机碳源，又需要无机碳源和光照条件，可同时进行好氧呼吸和光合作用，兼具自养和异养的优点。目前兼养培养模式已有相关报道应用于小球藻叶黄素的生产（Chen, J.H., Chen,C.Y., Chang, J.S., 2017. Lutein production with wild-type and mutant strainsof Chlorella sorokiniana MB-1 under mixotrophic growth. J. Taiwan Inst. Chem.Eng. 79, 66-73）。乙酸盐、葡萄糖和甘油是微藻生长最常见的有机碳源。其中，采用乙酸盐兼养培养微藻具有碳利用效率高等特点，同时还可缓解户外培养中的杂菌污染问题（Boyle, N.R., Morgan, J.A., 2009. Flux balance analysis of primary metabolismin Chlamydomonas reinhardtii. BMC Syst. Biol. 3, 4）。适量的乙酸盐可促进微藻生长，但过量添加乙酸盐，藻细胞生长将受到抑制（Chen, C.Y., Ho, S.H., Liu, C.C.,Chang, J.S., 2017. Enhancing lutein production with Chlorella sorokiniana Mb-1 by optimizing acetate and nitrate concentrations under mixotrophic growth.J. Taiwan Inst. Chem. Eng. 79, 88-96）。乙酸盐的加入还可通过抑制CO₂固定、相关酶活性和相关基因转录而导致光合效率下降（Heifetz, P.B., Forster, B., Osmond,C.B., Giles, L.J., Boynton, J.E., 2000. Effects of acetate on facultativeautotrophy in Chlamydomonas reinhardtii assessed by photosyntheticmeasurements and stable isotope analyses. Plant Physiol. 122(4), 1439-1445），进而使得叶黄素含量降低（Jahns, P., Holzwarth, A.R., 2012. The role of thexanthophyll cycle and of lutein in photoprotection of photosystem II. BBA-Bioenergetics 1817(1), 182-193）。因此，当微藻利用乙酸盐作为有机碳源生产叶黄素时，应考虑如何同时保证藻细胞的快速生长和叶黄素的高效积累。