[发明专利]植物超长DNA的提取方法

权利要求书

1.植物超长DNA的提取方法，包括：

步骤1：细胞核分离：

样品与匀浆缓冲液以质量-体积比为1g：(8～15)mL混合，以20500rpm～35000rpm匀浆3次～5次，每次15s～25s；

步骤2细胞核纯化：

匀浆液以匀浆缓冲液稀释后过40μm～100μm滤膜，滤液于0～4℃，60rcf～90rcf离心2min～5min，离心后的沉淀以匀浆缓冲液重悬，-4℃～4℃裂解10min～60min；

2000rcf～3000rcf离心15min～25min，沉淀以匀浆缓冲液清洗2～3次，然后用核洗涤缓冲液洗涤2～3次；

步骤3：裂解细胞核：

洗涤后的沉淀以含有RNaseA的核裂解缓冲液于35～40℃裂解0.5～2h，然后以Proteinase K 48℃～52℃酶解2.5～3.5h；所述含有RNaseA的核裂解缓冲液与步骤1中所述样品的质量-体积比为1g：(5～20)mL；

步骤4：核内DNA纯化：

酶解后的细胞核依次经苯酚抽提、苯酚/氯仿/异戊醇抽提、氯仿/异戊醇抽提后，以无水乙醇沉淀，再以70vol％乙醇洗涤，获得植物超长DNA；

所述匀浆缓冲液的pH值为8.0，其由如下组分组成：

所述核裂解缓冲液pH值为8.0，由如下组分组成：

所述核洗涤缓冲液，pH值为8.0，由如下组分组成：

Tris-HCl 50mM；

EDTA 10mM。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1中，匀浆的条件为：35000rpm，4次，每次20s。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤2中：

所述匀浆液与匀浆缓冲液的体积比为1:1；

所述过40μm～100μm滤膜具体为依次过100μm、40μm滤膜；

所述裂解的温度为0℃，时间为30min。

4.根据权利要求1或3所述的提取方法，其特征在于，步骤2具体为：

匀浆液以等体积的匀浆缓冲液稀释后依次过100μm、40μm的滤膜，滤液于0～4℃，80rcf离心3min，离心后的沉淀以匀浆缓冲液重悬，0℃裂解30min；

2500rcf离心20min，沉淀以匀浆缓冲液清洗2～3次，然后用核洗涤缓冲液洗涤2～3次。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤3中，

所述RNaseA的浓度为3μL/mL，裂解的条件为37℃，1h；

所述Proteinase K的浓度为20μL/mL，酶解的条件为50℃，3h。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤4中，

所述苯酚抽提后，经4500rcf离心10min，取上清；

所述苯酚/氯仿/异戊醇抽提后，经4500rcf离心10min，取上清；

所述苯酚/氯仿/异戊醇的体积比为25：24：1，三者混合液的体积与上清的体积比为1：1；

所述氯仿/异戊醇抽提后，经4500rcf离心10min，取上清；

所述氯仿/异戊的体积比为24：1，二者混合液的体积与上清的体积比为1：1。

7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液还包括纤维素酶和/或果胶酶。