[发明专利]植物超长DNA的提取方法

说明书

本发明涉及DNA提取技术领域，尤其涉及植物超长DNA的提取方法。本发明提供的植物超长DNA的提取方法，包括：细胞核分离、细胞核纯化、裂解细胞核和核内DNA纯化四个步骤，该方法提取获得的DNA符合三代测序品台对DNA质量的要求，且能够获得良好的测序效果。经电泳检测，该方法提取获得的DNA具有较长的长度，且纯度和提取率皆较高。该方法不仅适用于普通样品的提取，对于多糖、多酚含量的样品也能够实现良好的提取效果。测序结果表明，采用本发明提供的方法提取的水稻DNA，数据N50可达52.3kb，椰枣DNA，数据N50可达60.2kb。

技术领域

本发明涉及DNA提取技术领域，尤其涉及植物超长DNA的提取方法。

背景技术

超长DNA(ultra-long DNA)，或称高分子量DNA(high-molecular-weight DNA)，是指片段长度在数百Kb甚至数Mb的DNA。超长DNA可应用于各种现代组学研究中，例如，大跨度目标区域的分离、鉴定和分析，BAC构建，YAC构建，基因组测序等。

近十年来随着二代、三代测序技术的迅猛发展，植物基因组数据呈井喷式增长。但是，由于植物基因组高重复性、多倍体特性，且受限于二代测序读长短，组装获得的基因组完整性、连续性并不理想。现有研究显示，测序的读长长度是影响基因组组装完整性、连续性的关键因素，读长长度较测序深度更为重要；较长的读长，有利于转座子富集区、着丝粒区域、重复区域等结构复杂区域的组装，能够显著提高基因组组装的完整性和连续性。

使用传统的DNA提取手段获得的DNA片段长度仅在50kb左右，不会超过100kb。而以NanoPore、PacBio为代表的三代测序技术具有长读长的特点，三代测序平台对DNA质量要求为：1、OD260/280比值范围在1.8～2.0，OD260/230比值范围在2.0～2.5；2、Nanodrop/Qubit比值接近于1.0；3、浓度大于等于80ng/μL；4、DNA总量大于等于10μg。传统的DNA提取手段，所提取的DNA长度、纯度不能完全达到测序平台要求。而事实上，在研究过程中发现，即便达到平台要求，一些提取方法获得的DNA样品，也不能够实现良好的测序效果。例如：某次提取的水稻样品，使用核酸定量仪对该样本进行检测，各项指标均满足测序仪要求：

同时，脉冲电泳检测结果(图1)显示DNA大小集中在200Kb，并且有少量500Kb片段。但按照标准流程使用Oxford Nanopore PromethION平台进行测序，上机后产出仅为24G。而该平台植物基因组测序平均产量应在50～60G。这说明核酸定量仪检测数据仅能作为参考，即便检测结果符合测序要求，也不一定就能够获得良好的测序结果。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供植物超长DNA的提取方法，该方法提取获得的DNA符合长读长测序平台对DNA质量的要求，且能够获得良好的测序效果，例如以Oxford Nanopore和PacBio为代表的三代测序平台。

本发明提供的植物超长DNA的提取方法，包括：

步骤1：细胞核分离：

样品与匀浆缓冲液混合，以20500rpm～35000rpm匀浆3次～5次，每次15s～25s；

步骤2细胞核纯化：

匀浆液以匀浆缓冲液稀释后过40μm～100μm滤膜，滤液于0～4℃，60rcf～90rcf离心2min～5min，离心后的沉淀以匀浆缓冲液重悬，-4℃～4℃裂解10min～60min；

2000rcf～3000rcf离心15min～25min，沉淀以匀浆缓冲液清洗2～3次，然后用核洗涤缓冲液洗涤2～3次；

步骤3：裂解细胞核：