[发明专利]一种短串联重复序列通用探针及其设计方法和应用

说明书

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种用于同时检测基因组多个位点的通用探针和引物设计方法及其应用试剂盒。所述通用探针采用短串联重复序列作为骨架序列，解决了拷贝数浓度放大的反应体系内探针数量过多，易于形成非特异性扩增及合成成本高昂的问题。通过在待测染色体单拷贝基因片段通用探针位置的两侧设计多对引物，实现了染色体拷贝数浓度的等比例放大，尤其适用于某些极低浓度样品的检测(例如无创检测染色体拷贝数是否发生变异)。

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种短串联重复序列通用探针及其设计方法和应用。

背景技术

20世纪80年代后期，Marshfield医学研究基金会的James和俄勒冈健康科学大学的Wis等人分离出来一种比小卫星DNA具有更短重复单元的卫星DNA，被称作微卫星DNA(Microsatellite DNA)、短串联重复(Short Tandem Repeats,STRs)或简单序列重复(Simple Sequence Repeats,SSRs)，每个重复单元长度在1～6bp之间。STR符合孟德尔遗传模式，共显性表达，广泛分布于真核生物的基因组中。按照重复基序可以分为3种类型：单一型(如(AC)n)、复合型(如(AC)m (AG)n)和间断型(如(AC)m T(AG)n)。按照重复的碱基数，又可以分为单碱基重复(如(A)n)，双碱基重复(如(AC)n)，三碱基重复(如(ATC) n)，多碱基重复(如((ATCT)n、(ACATG)n、(ATGATG)n等)。

无创产前基因检测(NIPT)是利用新一代高通量测序(NGS)检测胎儿染色体异常的检测技术。通过采集孕妇外周血，对母体外周血中的游离DNA片段 (包括胎儿游离DNA)进行测序，结合生物信息分析，计算胎儿患染色体非整倍体的风险。该技术比传统的血清学筛查更准确，比容易造成流产的羊水穿刺更安全。然而，基于NGS的无创产前检测技术存在着检测周期长、技术门槛高、检测费用高等不足，阻碍了其成为普查项目。

数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术。其核心是基于泊松分布的原理，将核酸样品分散到几万个微孔的芯片中或者包被于液滴中，分散成纳升级的扩增体系，通过大规模单分子扩增实现拷贝数的绝对定量。该技术避免了传统荧光定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)的相对定量步骤，直接获知目标核酸分子的拷贝数浓度，提高了检测灵敏度和准确度。数字PCR技术用于无创产前基因检测，单一位点的拷贝数很低，难以达到最佳的检测范围，因此需要进行多个位点检测后取总拷贝数进行分析。目前的数字PCR探针设计需要考虑碱基序列的因素，比较复杂而且成本高昂。因此，急需发明一种新型的可应用于无创检测染色体拷贝数是否发生变异的数字PCR通用探针。

发明内容

本发明公开了一种新型的用于数字PCR的通用探针，具有设计简单、制备成本低等优点。具体技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种用于数字PCR的探针，所述探针的序列采用短串联重复序列作为骨架序列，所述短串联重复序列按照重复基序区分，包括单一型(用结构式(X)n表示)、复合型(用结构式(X)n(Y)m表示)和间断型 (用结构式(X)n Z(Y)m表示)，其中X为A、C、G、T四种碱基中的一种或 2-6个碱基组合，Y为A、C、G、T四种碱基中不同于X的一种或2-6个碱基组合， Z为A、C、G、T四种碱基中不同于X和Y的一种或多个碱基的组合，n和m为重复的单元数。

优选的，所述探针的长度为8-40bp；探针的5’端标记荧光报告基团，探针的 3’端标记荧光淬灭基团。

更优选的，所述荧光报告基团为FAM、VIC、ROX或CY5，所述荧光淬灭基团为MGB。

应当理解，本发明的荧光报告基团并不限于FAM、VIC、ROX或CY5，本发明的荧光淬灭基团并不限于MGB，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适的荧光报告基团和荧光淬灭基团来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。