[发明专利]肾移植供体特异性尿源细胞及其DNA的制备方法以及其应用

说明书

本发明涉及肾移植供体特异性尿源细胞及其DNA的制备方法以及其在肾移植供体基因组学背景分析中的应用。本发明尿源细胞的制备方法包括以下步骤：(1)取肾移植受体的中段尿，离心，弃上清；(2)向离心所得下层沉淀中加入含有青链霉素混合液或原代细胞抗生素的磷酸盐缓冲液进行重悬，然后再次离心，弃上清；(3)向离心所得下层沉淀中加入尿源细胞培养基，重悬，得到细胞悬液；(4)将所得细胞悬液接种于培养容器中，进行细胞体外扩增，得到肾移植供体特异性尿源细胞。本发明基于肾移植术后受体尿液获取的供体特异性尿源细胞，获得供体DNA，进行供体基因组学背景分析，其安全无创、成本低廉且分离效率高，易于获得足够数量的DNA。

技术领域

本发明涉及一种肾移植供体特异性尿源细胞及其DNA的制备方法及其在肾移植供体基因组学背景分析(如HLA高分辨率分型检测等)中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

肾移植作为终末期肾脏疾病的最优治疗方案，被广泛应用于临床。然而，移植后受体对移植物产生的免疫反应可能造成包括急慢性免疫排斥、移植物失功等在内的多种不良预后，严重影响移植效果^[1]。而明确的供体基因组学背景，对预防及治疗各种移植术后不良事件的发生，有重要意义。而在基因组学背景中，以供体人白细胞抗原(HLA)的基因型背景对术后不良事件的影响最大。

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是人类的主要组织相容性复合体，控制机体识别“自身”和“异己”的过程，参与异体抗原提呈，启动特异的免疫反应。然而在识别异己的同时，它也成为了异体器官移植的主要障碍，是决定移植排斥水平的重要因素。在器官移植时，供体和受体HLA相容程度越高，排斥水平越低，移植成功率和移植物长期存活率越高；反之，则容易发生排斥反应，移植物功能损伤越严重^[2]。因此，获取供受体双方的HLA分型，鉴定HLA的基因型构成，可明确供受体之间的HLA差异，进而科学的决定器官分配。

早期HLA的检测包含血清学检测，如淋巴细胞毒实验；随着分子技术的进步，逐渐过渡到基于多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的DNA序列分析分子诊断为主导，包含PCR序列特异引物(PCR-SSP)和PCR序列特异的寡核苷酸引物(PCR-SSO)方法^[3]。随着高通量测序技术的发展，采用高通量测序技术获取HLA基因高分辨率分型结果被认为是最可靠的标准。HLA高分辨率分型结果包含3种Ⅰ类HLA(HLA-A，HLA-B，HLA-C)和三种Ⅱ类HLA(HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP)的基因型信息。这一技术推动了器官移植供受者选择系统的发展，使两者的匹配达到更为精准的层面^[4]。

通过对供体特异性的HLA高分辨率分型结果分析，可以获取供体特异性的抗原表位(epitope)。这种筛选相对于传统血清学反应模式，将提供一个更科学可用的匹配系统，大大提高了配型的精度，从而提高术后移植物功能和患者生存质量^[5-8]。

同时，明确供体的HLA高分辨分型对于器官移植患者术后管理意义重大。供体特异性抗体(donor specific antibody,DSA)介导的排斥反应(antibody-mediatedrejection，AMR)是导致移植物远期失功的首要危险因素。AMR的诊断和治疗效果评价依赖于明确DSA位点。临床上，首先检测受者外周血的群体反应性抗体(panel reactiveantibodies，PRA)，然后结合和比对供体HLA高分辨分型结果，来最终判定DSA位点，明确AMR的诊断，调整后续治疗。