[发明专利]肾移植供体特异性尿源细胞及其DNA的制备方法以及其应用

权利要求书

1.一种肾移植供体特异性尿源细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取肾移植受体的中段尿，离心，弃上清；

(2)向步骤(1)离心所得下层沉淀中加入含有青链霉素混合液或原代细胞抗生素的磷酸盐缓冲液进行重悬，然后再次离心，弃上清；

(3)向步骤(2)离心所得下层沉淀中加入尿源细胞培养基，重悬，得到细胞悬液；

(4)将步骤(3)所得细胞悬液接种于培养容器中，进行细胞体外扩增，得到肾移植供体特异性尿源细胞。

2.如权利要求1所述的肾移植供体特异性尿源细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，尿源细胞培养基含有下述组分：REGM培养基、DMEM-high Glucose培养基、非必需氨基酸细胞培养添加物、GlutaMAX添加剂和胎牛血清。

3.如权利要求1所述的肾移植供体特异性尿源细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，培养容器经明胶溶液包被处理。

4.如权利要求1所述的肾移植供体特异性尿源细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，细胞体外扩增的方法为：将细胞悬液接种于培养容器中后，先置于培养箱内静置培养，然后更换新鲜尿源细胞培养基，继续培养至细胞汇合度达到60％-80％，再用EDTA胰酶消化传代，将细胞扩增至所需的数量。

5.一种肾移植供体特异性尿源细胞DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)采用权利要求1～4任一项所述方法制备数量不低于1×10⁶的肾移植供体特异性尿源细胞；

(b)从肾移植供体特异性尿源细胞中提取DNA，得到肾移植供体特异性尿源细胞DNA。

6.如权利要求5所述的肾移植供体特异性尿源细胞DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，从肾移植供体特异性尿源细胞中提取DNA的方法包括以下步骤：

(b1)采用EDTA胰酶对肾移植供体特异性尿源细胞进行消化，终止消化后加入磷酸盐缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液；

(b2)向步骤(b1)所得细胞悬液中加入RNA酶A和蛋白酶K进行处理，然后加入无水乙醇，振荡混匀，出现絮状沉淀；

(b3)将步骤(b2)所得溶液和絮状沉淀均加至吸附柱中，离心，去除废液，再采用漂洗液清洗吸附柱至少一次，然后将洗脱缓冲液加至吸附柱的吸附膜中间部位，放置后离心，收集洗脱缓冲溶液，得到肾移植供体特异性尿源细胞DNA。

7.如权利要求1～4任一项所述方法制备得到的肾移植供体特异性尿源细胞或如权利要求5或6所述方法制备得到的肾移植供体特异性尿源细胞DNA在肾移植供体基因组学背景分析中的应用；优选地，所述基因组学背景分析为HLA分型分析。

8.一种肾移植供体HLA分型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求5或6所述方法制备肾移植供体特异性尿源细胞DNA，检测所得DNA中HLA分型，得到肾移植供体HLA分型结果。

9.如权利要求8所述的肾移植供体HLA分型的检测方法，其特征在于，所述检测所得DNA中HLA分型的方法为：采用高通量测序检测所得DNA中HLA高分辨率分型，得到肾移植供体HLA高分辨率分型结果。

10.如权利要求9所述的肾移植供体HLA分型的检测方法，其特征在于，所述高通量测序检测所得DNA中HLA高分辨率分型的方法为：先进行HLA-A/B/C/DRB1/DQB1/DPB1位点基因扩增并汇集扩增子序列，然后进行酶切修饰，将每个样本添加“条码”信息，再进行高通量测序，分析测序所得数据，得到肾移植供体HLA高分辨率分型结果；优选地，所述HLA-A/B/C/DRB1/DQB1/DPB1位点基因扩增采用的试剂盒为NGSgo-AmpX试剂盒；所述酶切修饰采用的试剂盒为NGSgo LibrX试剂盒；所述添加“条码”信息采用的试剂盒为NGSgo-Indx试剂盒。