[发明专利]一种固相片段法合成比伐卢定

说明书

本发明公开了一种固相片段法合成比伐卢定，该方法以三苯甲基氯类型树脂作为起始树脂，采用固相合成1‑9全保护肽树脂，将全保护九肽从树脂上切割下来后在固相中接入10‑20肽树脂，经裂解得到比伐卢定粗品。该方法的亮点以及优势是使用了固相片段法合成替代逐步法合成比伐卢定减少脱保护次数，避免¹⁰Gly‑⁹Asn肽序结构在碱性条件下发生五元环重排副反应，有效降低杂质Asp⁹和β‑Asp⁹的含量。本发明工艺操作简单，粗品纯度高，制备后产品纯度达到99.8％，单杂小于0.1％，具备良好的工业化生产前景。

发明领域

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及比伐卢定的固相片段合成方法。

背景技术

比伐卢定于2000年和2004年先后经过美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMEA)批准上市，在临床上用于经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronaryintervention PCI)围术期的抗凝治疗。其有效抗凝成分为水蛭素衍生物片段，通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用，无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，本品均可与其催化位点和阴离子结合位点(又称底物识别位点)发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性。其作用与肝素不同，它不依赖于抗凝血酶、肝素辅因子等。凝血酶是凝血反应中起核心作用的丝氨酸蛋白酶：它水解纤维蛋白原生成纤维蛋白单体；激活凝血因子；促进纤维蛋白交联形成稳定血栓的共价结构。同时，凝血酶激活凝血因子；激活血小板，促进血小板聚集和颗粒释放。因凝血酶可水解本品多肽顺序3#Arg和4#Pro之间的肽键，使本品失活，所以本品对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的。

比伐卢定为人工合成的二十肽，20位氨基酸残基组成的线性肽，其中1位为D型Phe，其肽序结构为：H-D-Phe¹-Pro²-Arg³-Pro⁴-Gly⁵-Gly⁶-Gly⁷-Gly⁸-Asn⁹-Gly¹⁰-Asp¹¹-Phe¹²-Glu¹³-Glu¹⁴-Ile¹⁵-Pro¹⁶-Glu¹⁷-Glu¹⁸-Tyr¹⁹-Leu²⁰-OH

化学结构式如下：

现有专利情况

美国US5196404，该专利采用标准Boc化学固相多肽合成法，需要用剧毒的HF作为裂解试剂，裂解时需要特殊的反应装置及操作人员防护设备，不适合规模化生产。中国专利CN101094867、CN101033249和CN101555274采用标准Fmoc多肽固相合成法，避免了强酸切割的风险，但粗品副产物较多，纯品收率仅为14％左右(CN101033249)，不利于工业化生产。

中国专利CN101475631、CN103864895、CN102816208和CN105273062采用多肽片段液相拼接的方法来合成比伐卢定，将比伐卢定分成三个、四个或五个多肽片段，在液相中完成片段的拼接。该方法片段与片段间缩合效率不高，多肽片段原料及每步拼接产物都需要纯化，废液量大，生产成本较高。

比伐卢定肽序中10位Gly与9位Asn之间的酰胺键与侧链的氨基由于空间位阻的影响，在偶联以及裂解过程中，酸性以及碱性条件下中间体五元环发生重排反应，生成杂质Asp⁹和β-Asp⁹等杂质，由于这些杂质性质与比伐卢定类似，极性相近，从而大大增加了比伐卢定粗品纯化的难度，由于Asp⁹和β-Asp⁹等杂质均为降解杂质，需要在合成工艺中有效控制杂质的含量。副产物反应机理如下：