[发明专利]一种固相片段法合成比伐卢定

权利要求书

1.一种比伐卢定的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将Fmoc-Leu-OH在催化剂中与Wang Resin相连，得到Fmoc-Leu-Wang Resin；

2)采用固相合成法Fmoc/tBu策略依次连接比伐卢定肽序中第20位到第10位氨基酸,脱保护后得到11肽树脂H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Resin，即片段一；

3)Fmoc-Asn(Trt)-OH与CTC树脂偶联得到Fmoc-Asn(Trt)-CTC Resin；

4)采用固相合成法Fmoc/tBu策略依次连接比伐卢定肽序中第9位至第1位氨基酸，得到Fmoc保护的9肽树脂Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTCResin；

5)采用TFEA/DCM体系裂解切割片段肽9肽树脂得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH，即片段二；

6)片段一与片段二通过固相法在HBTU/HOBt/DIEA/DMF体系中偶联得Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang Resin；

7)使用20％PIP/DMF脱除Fmoc得到比伐卢定肽树脂

H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang Resin；

8)使用裂解试剂，室温搅拌2～3h，采用甲基醚沉降得到比伐卢定粗肽。

2.一种比伐卢定的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)片段一肽树脂的合成

将Wang树脂加入固相反应器，加入DMF，将Fmoc-Leu-OH、DMAP和HOBt溶解于DMF中，在加入DIC，随后加入到固相反应器中，加入PIP/DMF脱Fmoc保护；

将Fmoc-Tyr(tBu)-OH和HOBt溶解于DMF中，加入DIC，加入固相反应器中，加入PIP/DMF脱Fmoc保护；

重复以上步骤，依次连接Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，得到片段一肽树脂H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Resin。

2)片段二肽树脂的合成

将CTC-Cl树脂加入固相合成反应釜，加入DCM溶胀，用DMF洗涤，随后加入Fmoc-Asn(Trt)-OH和DIEA，室温搅拌，过滤，采用DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，

将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和HOBt溶于DMSO中，加入DIC，预活化，随后加入固相反应器中，搅拌反应，抽干，DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，

重复以上步骤，依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH，经洗涤干燥后得到片段二肽树脂Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin；

3)片段二的合成

将Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，加入TFEA/DCM搅拌反应，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH固体；

4)比伐卢定粗品的合成。

将片段二Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH、PyBop、HOBt溶解于DMF中，加入DIEA，随后加入装有片段一肽树脂的固相反应器中，在室温搅拌，抽干，洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，洗涤，干燥后可得到比伐卢定肽树脂，

将比伐卢定肽树脂加入到裂解试剂(TFA:TIS:H₂O＝95:2.5:2.5)中，室温搅拌反应，过滤，将滤液中加入到甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到比伐卢定粗肽。