[发明专利]电缆细菌Candidatus Electronema的检测引物、试剂盒及定量方法

说明书

本发明公开了一种电缆细菌Candidatus Electronema的检测引物、试剂盒及定量方法。利用本发明的检测引物按照本发明的检测方法能够定量检测环境样本中电缆细菌Candidatus Electronema丰度，最低检测限为10拷贝/μL，要比目前的FISH定量的检测限和灵敏度提高10000倍以上。本发明的检测引物、试剂盒和定量方法具有灵敏度高、准确性强、重复性好、特异性强的特点，定量检测线性范围可达10¹‑10⁸拷贝/μL。

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种电缆细菌CandidatusElectronema的检测引物、试剂盒及定量方法。

背景技术：

电缆细菌(Cable bacteria)，是一种来源于Desulfobulbaceae家族的多细胞长线状细菌，通过厘米尺度的长距离电子传递(long distance electron transfer，LDET)产生电流来耦合沉积物空间隔离的深层无氧区域的硫化物氧化反应和表层有氧区域的氧气还原反应，这挑战了人们长期认同由分子扩散来控制的氧化还原分带的观点。此外，电缆细菌在全球分布非常广泛，包括海洋、红树林、盐沼地、淡水等多种多样沉积物环境，电缆细菌对全球生物地球化学元素循环起着显著推动作用。当LDET活跃的时候，电缆细菌可以促进硫铁复合物的溶解，引起沉积物中溶解态的硫、铁和钙的移动和重新分配，耦合沉积物及其底层水的铁-磷和铁-锰等元素的动态循环，在沉积物表面形成致密的羟基氧化铁或者氧化铁阻止沉积物中有毒硫化氢向水中扩散，从而保护水体生命。电缆细菌的发现是目前电微生物学非常令人兴奋的现象，引起了越来越多的国内外研究学者的研究和关注。

然而，电缆细菌到目前为止仍没有获得纯培养，传统的荧光原位杂交技术(FISH)最低检测极限为每立方厘米1.5*10⁶的电缆细菌细胞，灵敏度和重复性都很低。荧光定量PCR方法以其特异性强、灵敏度高、定量准确、重复性好、速度快等优点成为了环境中定量检测低丰度物种的首选分子生物学方法。

因此，建立荧光定量PCR方法定量检测环境中电缆细菌丰度成为了当前研究的技术难点之一。

发明内容：

又鉴于此，本发明的目的在于针对现有对环境中电缆细菌直接定量的技术灵敏度和准确度的不足，提供了一种电缆细菌Candidatus Electronema的检测引物、试剂盒及定量方法，快速定量检测环境中电缆细菌，提高检测结果的灵敏度。

本发明的第一个目的是提供一种电缆细菌Candidatus Electronema的检测引物，所述的检测引物如下所示：

上游引物F：5’-CATCGAGTACATCCGCGAAC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物R：5’-AAATCAGCAATCAGCGCGTC-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

本发明的第二个目的是提供一种电缆细菌Candidatus Electronema的检测试剂盒，包括TB Green Premix Ex Taq II、阳性标准品和检测引物，所述的阳性标准品为含有如SEQ ID NO.3所示序列的重组质粒DNA序列，所述的检测引物为权利要求1所述的检测引物。

本发明的第三个目的是提供一种电缆细菌Candidatus Electronema的检测方法，包括以下步骤：提取待测沉积物样品的基因组DNA作为模板，加入所述的检测引物，与TBGreen Premix Ex Taq II混合形成扩增反应体系，进行荧光定量PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断待测沉积物样品中是否含有电缆细菌Candidatus Electronema。