[发明专利]电缆细菌Candidatus Electronema的检测引物、试剂盒及定量方法

权利要求书

1.一种电缆细菌Candidatus Electronema的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

上游引物F：5’-CATCGAGTACATCCGCGAAC-3’；

下游引物R：5’-AAATCAGCAATCAGCGCGTC-3’。

2.一种电缆细菌Candidatus Electronema的检测试剂盒，包括TB Green Premix ExTaq II、阳性标准品和检测引物，其特征在于，所述的阳性标准品为含有如SEQ ID NO.3所示序列的重组质粒DNA序列，所述的检测引物为权利要求1所述的检测引物。

3.一种电缆细菌Candidatus Electronema的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测沉积物样品的基因组DNA作为模板，加入权利要求1所述的检测引物，与TBGreenPremix Ex Taq II混合形成扩增反应体系，进行荧光定量PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断待测沉积物样品中是否含有电缆细菌Candidatus Electronema。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的根据扩增曲线判断待测沉积物样品中是否含有电缆细菌Candidatus Electronema的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，且CT值小于35，则说明待测沉积物样品中含有电缆细菌Candidatus Electronema，如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明待测沉积物样品中不含有电缆细菌CandidatusElectronema。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的扩增反应体系为：每25μL包括以下组分：10μmol/L的权利要求1所述的上游引物F和下游引物R各1μL、TB Green PremixEx Taq II 12.5μL、模板DNA 1μL和超纯水9.5μL；所述的荧光定量PCR反应，其反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性5s，56℃退火30s，72℃延伸5s，收集荧光信号强度，重复40个循环。

6.一种电缆细菌Candidatus Electronema丰度的定量方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将如SEQ ID NO.3所示的序列连接到质粒上，构建得到重组阳性质粒，将阳性质粒进行梯度稀释以用作不同起始质粒浓度的模板，分别加入权利要求1所述的检测引物，与TBGreen Premix Ex Taq II混合形成扩增反应体系，进行荧光定量PCR反应；

(2)反应结束后得到各起始质粒浓度模板对应的扩增循环数CT值，该CT值与起始质粒浓度的常用对数呈线性关系，据此得到电缆细菌Candidatus Electronema的qPCR标准曲线；

(3)提取待测沉积物样品的基因组DNA作为模板，加入与步骤(1)中相同体系的上述检测引物，与TB Green Premix Ex Taq II混合形成扩增反应体系，进行荧光定量PCR反应，反应结束后得到CT值，将其代入电缆细菌Candidatus Electronema的qPCR标准曲线，计算得到待测沉积物样品中电缆细菌的丰度。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)和(3)所述的扩增反应体系为：每25μL包括以下组分：10μmol/L的权利要求1所述的上游引物F和下游引物R各1μL、TBGreen Premix Ex Taq II 12.5μL、模板DNA 1μL和超纯水9.5μL；步骤(1)和(3)所述的荧光定量PCR反应，其反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性5s，56℃退火30s，72℃延伸5s，收集荧光信号强度，重复40个循环。