[发明专利]一种脱细胞神经支架的制备方法及其效果评价方法

说明书

本发明公开了一种脱细胞神经支架的制备方法及其效果评价方法，该制备方法采用TritonX‑100加冻融酶的复合方法进行脱细胞神经支架制备。通过形态学观察、超微结构观察、细胞毒性检测、生物相容性检测、复合体冰冻切片观察等方法对脱细胞神经支架的脱细胞效果进行评价。结果显示采用TritonX‑100加冻融酶的复合方法制备的脱细胞神经支架，脱细胞效果充分、支架三维空间结构完整、管道通畅，与细胞、组织相容性好，炎症反应轻微，细胞生长增殖状态良好，适合细胞的黏附生长，是一种理想的支架材料。

技术领域：

本发明涉及一种脱细胞神经支架的制备方法及其效果评价方法，属于神经支架材料技术领域。

背景技术：

脊髓损伤是常见的高致残率疾病，不但危及患者生命，降低患者的生活质量，巨额的医疗费用给家庭和医疗卫生系统带来沉重的经济负担。因此，寻找有效治疗脊髓损伤的治疗措施迫在眉睫。随着组织工程学的发展,组织工程成为修复中枢神经系统损伤治疗的研究热潮，其关键是应用理想的支架材料，选择合适的种子细胞，结合促进细胞生长的信号因子，构建组织工程化复合体。支架是支撑细胞成长的框架材料，充当植入细胞的附着基质，可以促进细胞的黏附生长，因此选择合适的支架是组织工程应用的关键。

自体神经支架无免疫排斥反应，是脊髓支架的最佳来源，但是自体移植给患者造成二次创伤，增加了手术感染风险，还可能造成供体区的功能缺损，因此限制了其在临床中的广泛应用。研究者开始寻找、研发合适的支架材料来替代自体神经支架。理想的神经支架应该具有良好的组织、细胞生物相容性，利于细胞的黏附、生长，促进轴突的延伸以及对其进行导向作用的特性，从而达到和自体支架相似的功能恢复。

目前已有的支架材料主要包括：天然来源的支架材料和人工合成的支架材料。天然来源的支架材料，如细胞外基质成分（ECM），蚕丝蛋白，利于细胞黏附，其生物力学特性较差，可塑性不强。人工合成材PGA,PLA,PLGA是首批用于神经修复研究的合成支架材料，其物理特性包括具有一定的机械强度，柔韧性，可降解性，渗透性，这些特性可以使他们被优化制备成各种既定形式，但是合成支架材料具有一定的细胞毒性，且生物相容性较差，致使宿主出现较强的炎症应答。有的合成支架材料，虽然能与宿主达到免疫耐受，但与细胞相容性差，不利于细胞的黏附和组织修复。复合支架材料虽然弥补了单一合成材料的不足，但与正常的神经三维空间结构和理化性质还有一定的差距。

天然神经固有的空间形态能够介导再生轴突的延伸。商业化的组织工程化的支架通常是中空的导管，缺乏这种天然的结构空间，因此很多研究人员致力于模仿天然神经，赋予材料支架相似的空间构架，使再生的轴突更好的适应其内环境。制造仿生生物材料基质的常用方法是电纺技术。在体外，电纺支架被证明能够促进细胞的迁移，介导背根神经节轴突的伸展，电纺支架通常是由合成材料制作而成的，如PCL,PAN,PLLA,还有一些天然的材料，像蚕丝，胶原蛋白等。在体内，复合电纺纤维被证明在坐骨神经损伤动物模型中确实能促进轴突的再生，包括神经纤维数量，电活动及运动功能的恢复。这些研究证明支架制作中，与天然神经空间结构相似设计的重要性，其能协助再生轴突向损伤远端延伸前行。除空间构型，很多工程化的导管加入了一些细胞因子，如生长因子和黏附因子，如生长因子NGF，细胞外基质蛋白（ECM），层粘连蛋白。层粘连蛋白通过特殊的多肽序列以及整合信号来介导细胞的黏附、存活，再生轴突伸展，因此它在神经再生方面的功能已经被很好的研究。此外，层粘连蛋白还可以通过层粘连蛋白结合位点充当递送睫状神经营养因子（CNTF），脑源性神经营养因子（BDNF）的介质。在体研究发现，单纯的层粘连蛋白可以提高髓鞘化的轴突数量，通过层粘连蛋白结合位点控释CNTF能促进坐骨神经损伤后轴突再生及传导速度，控释BDNF、CTNF同样能提高大鼠面神经的复合肌肉动作电位（CMAP）。综上所述，生化因素的介入，如层粘连蛋白, CNTF,BDNF等会进一步促进功能修复。