[发明专利]一种脱细胞神经支架的制备方法及其效果评价方法

权利要求书

1.一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于采用TritonX-100加冻融酶的复合方法进行脱细胞神经支架制备，包括如下步骤：

1.1动物称重，以质量浓度3.5%的水合氯醛麻醉动物，待麻醉生效后，用体积浓度75%的乙醇浸泡消毒10-15min，切片，分离肌肉，无菌条件下切取双侧坐骨神经；将坐骨神经放于装有超纯水的培养皿中，室温下震荡24-25小时；

1.2在质量浓度0.5%的TritonX-100溶液中震荡36-37小时；

1.3然后转入液氮中反复冻融5-6次；

1.4将冻融后的坐骨神经移入装有胰酶的培养皿中，37℃过夜；然后用DNase-I、RNase-A进行处理，37℃ 2-2.5h；

1.5后转入蒸馏水中振荡、漂洗，每1-1.5小时换液1次；

1.6将坐骨神经取出，进行修剪定型，即为做好的脱细胞支架材料，转入PBS缓冲液中4℃，pH 7.2保存；

1.7脱细胞支架材料消毒处理：支架消毒剂选用质量浓度为0.1％的PAA；室温下，将脱细胞支架材料放入15ml离心管中，倒入新鲜配置的质量浓度为0.1％的PAA，浸泡消毒 3-3.5 h，超净台内无菌PBS震荡24-25h，毎2-2.5h换液一次，漂洗结束，封口膜封管，4℃保存备用。

2.一种脱细胞神经支架的制备方法的效果评价方法，其特征在于包括如下步骤：

A组（未处理组）：新鲜对照神经；

B组（TritonX-100 加酶组）：脱细胞神经支架；

C组（NaOH组）：脱细胞神经支架；

D组（TritonX-100加冻融酶组）：脱细胞神经支架；

2.1 脱细胞神经支架组织形态学观察

将各组神经进行HE染色处理，HE染色结果显示，D组（TritonX-100加冻融酶组）许旺细胞，轴突及髓鞘等成分基本完全脱除，未见散在的细胞核及周边束膜、外膜，支架结构松散适度，Laminin保留充分，基底膜基本完整；

2.2脱细胞神经支架超微结构观察

通过透射电镜、扫描电镜分别观察各组神经；

透射电镜结果显示，D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架轴突、施万细胞去除彻底，细胞外基质成分良好，显微结构松散有序；扫描电镜结果显示，D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架，轴突、髓鞘成分几乎完全消失，管内未见残留结构，基膜完整，基膜管更通畅，基底膜管排列整齐，空隙均匀，空间骨架结构保存良好，为细胞的黏附生长提供了理想的三维空间；

2.3脱细胞神经支架DNA含量测定

对各组神经进行DNA含量测定；

DNA含量测定结果显示：D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架DNA含量最低，95%DNA被去除；

2.4 CCK-8细胞毒性检测

对各组神经进行CCK-8细胞毒性检测；

CCK-8测定结果显示：D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞数目无明显降低，细胞生长状态良好；

2.5脱细胞神经支架细胞生物相容性测定

将各组神经进行细胞生物相容性测定；

细胞生物相容性测定结果：D组（TritonX-100加冻融酶组），可见大量细胞黏附，细胞充分伸展，黏附生长状态良好；

2.6脱细胞神经支架组织生物相容性测定

将各组神经进行组织生物相容性测定；

组织生物相容性测定结果：D组（TritonX-100加冻融酶组）炎症反应轻微，可见炎症细胞极少；

2.7细胞支架复合体冰冻切片观察

将各组神经的细胞支架复合体冰冻切片观察；

细胞支架复合体冰冻切片观察结果：D组（TritonX-100加冻融酶组）显示大量细胞黏附生长，密度较大且分布均一；

2.8细胞支架复合体扫描电镜观察

将各组神经的细胞支架复合体扫描电镜观察；

细胞支架复合体扫描电镜观察结果：D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞大量黏附生长，细胞胞体饱满，突起充分伸展，贴附与支架空隙间。