[发明专利]V5V6区引物解析植物内生细菌菌群的方法

说明书

本发明公开了V5V6区引物解析植物内生细菌菌群的方法。本发明提供用于解析植物内生细菌菌群的引物对，由引物甲和引物乙组成，靶序列为细菌16S rDNA的V5‑V6区的全长或部分；所述引物甲是核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA分子，所述引物乙与植物线粒体18S rDNA对应，且引物乙的3’末端与植物线粒体18S rDNA有3个连续的差异核苷酸，且引物乙全长与植物线粒体18S rDNA的差异核苷酸大于等于4个。本发明利用上述引物对及具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶，获得了纯的植物内生细菌菌群16S扩增子；并结合二代测序平台建立了无污染扩增内生细菌菌群的测序实验平台。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于解析植物内生细菌菌群的试剂和方法，特别涉及一种V5V6区引物解析植物内生细菌菌群的方法。

背景技术

植物的体表和体内定殖着种类繁多的微小生物，包括细菌、真菌、古菌、线虫、原生动物等等，统称为植物微生物群落。植物微生物群落与宿主植物共栖，在营养生长、发育和抗胁迫三个方面影响着宿主植物。植物微生物群落中数量最多的是细菌，按照细菌定殖在植物组织的表面或者内部，它们分别被定义为植物表面菌群和植物内生菌群。

植物微生物群落的研究方法有培养法和非培养法两大类，借助于16S rDNA扩增子测序的二代高通量测序是非培养法研究的经典方法，相比于培养法，该方法具有方便快捷、对菌群解析全面的优点。因此，16S扩增子测序是目前植物微生物群落研究应用最普遍的一种方法。16S rDNA是原核生物中保守的序列，被称为细菌分类鉴定的分子钟。16S rDNA由10个序列保守区和9个序列高变区交替排列组成，保守区序列在不同的细菌中具有很高的序列同源性，而高变区序列则具有物种特异性，由此，可以在16S rDNA的两个序列保守区设计一对引物，扩增出含有一个或几个高变区的序列片段，然后根据高变区的序列特异性对菌种进行分类鉴定。

采用16S扩增子测序研究植物细菌菌群研究最多的是植物根际菌群，而对于植物内生细菌菌群的解析，由于植物的叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA与细菌的16S rDNA有很高的同源性，导致一般的16S扩增子引物会同时扩增叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA，而这两种细胞器在数量上通常远远多于植物内生细菌，因此，扩增产物中往往伴随极高比例的宿主DNA污染，严重干扰后续的菌群分析。目前已发表的研究中，799F是唯一能够避开植物叶绿体污染的引物，但是仍没有能够避开植物线粒体污染的引物，使用799F与其它16S扩增子引物组合，其扩增产物伴有高比例的线粒体序列污染。

因此，急需设计菌群16S的特异性扩增引物来避开植物源DNA的污染从而获得只含有菌群16S扩增子的测序文库，为植物内生菌群的高效解析提供实验平台。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何实现对植物内生细菌菌群的16S扩增子进行无污染扩增，具体为如何避开植物线粒体污染实现对植物内生细菌菌群的16S扩增子扩增，进而准确解析植物内生细菌菌群。

为解决上述技术问题，本发明提供了用于解析植物内生细菌菌群的引物对，所述引物对的靶序列为细菌16S rDNA的V5-V6区的全长或部分；所述引物对由引物甲和引物乙组成，所述引物甲是核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA分子，所述引物乙与植物线粒体18S rDNA对应，且所述引物乙的3’末端与所述植物线粒体18S rDNA有3个连续的差异核苷酸，且所述引物乙全长与所述植物线粒体18S rDNA的差异核苷酸大于等于4个，所述引物乙除所述差异核苷酸外，其它核苷酸与所述植物线粒体18S rDNA的相应核苷酸相同或互补。

上述引物对中，所述对应是指引物乙可与植物线粒体18S rDNA的任一部分除差异核苷酸外相同或互补。所述植物线粒体18S rDNA的任一部分与引物乙长度相同。

上述引物对中，所述引物乙是核苷酸序列如序列表中序列2所示的单链DNA分子。