[发明专利]一种基于茎尖的辣木染色体核型分析方法

说明书

本发明公开了一种基于茎尖的辣木染色体核型分析方法，包括以下主要步骤：S1取材：在晴朗的上午采集健康辣木新枝茎尖为0.5‑1cm为试验材料；S2预处理:置于对二氯苯中预处理2.5h；S3:固定与保存；S4.染色体标本制备：采用酶解去壁低渗法，经前低渗、酶解、后低渗、涂片获得较佳的染色体标本，其中酶解采用4％纤维素酶和5％果胶酶混合物酶解4h；S5.染色:吉姆萨染色15min，S6:镜检。本发明提供了一种简单易操作，适用于原位PCR、FISH操作的辣木染色体核型分析方法，为辣木细胞学研究提供技术基础；本发明首次报道了辣木核型公式为2n＝2x＝2n＝28m，属于1B类型，核型不对称系数60.29％，属于较原始物种，为辣木的起源，演化及遗传育种提供一定理论依据。

技术领域

本发明属于涉及一种染色体核型分析方法，具体涉及一种基于茎尖的辣木染 色体核型分析方法，属于树木细胞学研究技术的领域。

背景技术

辣木(Moringa oleifera Lam)，又称鼓槌树，属辣木科(Mofingaceae)、 辣木属(Mornga)多年生乔木，原产于印度和非洲，辣木科仅有一属14种。 辣木含有丰富的纤维、维生素、矿物质、蛋白质、氨基酸、多糖、辣木素、皂苷、 酚类和活性酶类等成分，具有消炎、抑菌、降血糖、降胆固醇、凝血、抗氧化、 抗肿瘤和癌症等功能，因此，辣木又被誉为“神奇之树”和“母亲最好的朋友”。 很多发展中国家利用其来改善儿童营养不良，具有食用、园艺植物、工业、药用 等多种用途。

染色体核型分析技术能明确识别各个染色体的特征，有助于基因定位的研究， 它是细胞遗传学的一项基本技术，也是染色体工程、细胞分类学和植物育种学的 一个不可缺少的手段。目前，辣木细胞学上的研究仅局限于辣木染色体数量和倍 性的研究。Puri等以印度多油辣木材料的小孢子发育，观察到二倍体染色体数 2n＝28。张洁等以多油辣木栽培品种PKM1的茎尖为材料，同样得出二倍体染色 体数2n＝28。Mendioro等以花蕾为材料，也得出二倍体染色体数2n＝28。魏静和 向素琼等均以辣木茎尖为材料，均确定辣木为二倍体，染色体数2n＝28，初步得 出染色体长度和染色体组总长度。但最后均未能得到臂比、着丝点位置、核型的 不对称程度和核型公式等核型指标，进而进行核型分析。至今，有关辣木染色体 核型分析的研究未见报道。

发明内容

针对辣木染色体数目已有报道，但由于受染色体小，且细胞不够清晰，得不 到具体的相关数据导致目前辣木染色体核型还未见报道的现状。本发明提供了一 种基于茎尖的辣木染色体核型分析方法，该方法不仅能得到清晰可利于核型分析 的染色体，还适用于后期原位PCR、FISH等基因定位的研究。为辣木的起源，演 化及遗传育种提供一定的理论依据和技术基础。

为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

S1:取材

在晴朗的上午9：00-11:00采集健康、快速生长期的辣木新枝茎尖、小叶或大 叶；

S2：预处理

把刚采集的茎尖进行预处理；

S3:固定与保存

倒掉预处理液，清水冲洗后转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)，在 黑暗4℃环境下固定24h，移弃固定液，直接用来染色体制片，若需保存，把固 定过的茎尖依次在75％，90％，95％乙醇溶液各脱水3min，最后保存在75％乙醇 中保存备用；

S4:染色体标本制备

(1)前低渗:把S3固定的茎尖置于蒸馏水中进行前低渗30min；

(2)酶解:把步骤(1)的茎尖置于盛有5％纤维素酶和4％果胶酶混合液的 1ml离心管中，并置于37℃的恒温水浴锅中酶解3-5h；

(3)后低渗:吸取酶液，缓缓地沿着管壁加入蒸馏水，后低渗30min；