[发明专利]一种基于茎尖的辣木染色体核型分析方法

权利要求书

1.一种基于茎尖的辣木染色体核型分析方法，其特征在于：该分析方法具体步骤如下：

S1:取材

在晴朗的上午采集健康、快速生长期的辣木新枝茎尖、小叶或大叶；

S2：预处理

把刚采集的材料进行预处理；

S3:固定与保存

倒掉预处理液，清水冲洗后转入卡诺固定液，在黑暗4℃环境下固定24h，移弃固定液，直接用来染色体制片；

S4:染色体标本制备

(1)前低渗:把S3固定的茎尖置于蒸馏水中进行前低渗30min；

(2)酶解:把步骤(1)的茎尖置于盛有5％纤维素酶和4％果胶酶混合液的1ml离心管中，并置于37℃的恒温水浴锅中酶解3-5h；

(3)后低渗:吸取酶液，缓缓地沿着管壁加入蒸馏水，后低渗30min；

(4)后固定:吸取蒸馏水，滴加临时配制的固定液，后固定15min；

(5)涂片：把玻片、固定液均置于冰面上，取一张玻片，先滴固定液，再夹取茎尖组织置于玻片上，用解剖针挑取少量顶端组织，并迅速捣碎再均匀涂抹在载玻片上，再从一端滴加固定液使细胞扩散，接着在火焰上迅速烘烤，自然风干；

S5:染色

将缓冲液(甲液、乙液)与吉姆萨原液按比例配制成工作液，再把干燥的制片置于吉姆萨染色液中染色10-20min，清水冲洗干净，置烘箱37℃烘干；

S6:镜检

用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照，在40X物镜下对单位视野面积内处于分裂中期的细胞进行计数，选择30个染色体分散且形态较好的细胞进行染色体数目统计，选取5个染色体形态清晰且无重叠的细胞用Photoshop图像软件进行核型分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1所述的新枝茎尖最佳，长度为0.5-1cm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2所述的预处理为：8-羟基喹啉液处理2-3h或对二氯苯液处理1.5-2.5h，最佳预处理为对二氯苯液处理2h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4所述的染色体制片方法采用酶解去壁低渗法。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4所述的酶解采用纤维素酶和果胶酶酶解的最佳时间为4h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S5所述的采用吉姆萨染色的最佳时间为15min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S3所述的卡诺固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4所述的固定液为乙醇：冰醋酸＝3∶1。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S5所述的甲液为PH＝6.8的KH₂PO₄缓冲液、乙液为PH＝6.8的Na₂HPO₄缓冲液，甲液：乙液：吉姆萨原液的比例为22:27:1。