[发明专利]密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因及其应用

说明书

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域，公开了密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因及其应用。所述密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明提供的密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因是以模式作物水稻密码子为基础改造获得的，即在维持编码氨基酸序列不变的前提下，利用发明人从与水稻基因相关密码子中所筛选出的密码子替换原有密码子，得到植物化改造的Plant Nme2Cas9基因，再经过化学合成而来。采用本发明的基因可以明显提高剪切效率。

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体的，本发明涉及一种密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因，含有该密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因的表达盒、表达载体、打靶载体、转基因细胞以及它们的应用。

背景技术

CRISPR-核酸酶技术是近几年发展出的一种真核生物特异位点基因编辑技术。该技术所涉及的核酸酶目前发现的主要有两大类，而应用于基因编辑技术的通常来自于第二类。第二类CRISPR-核酸酶主要有三种类型：TypeII、TypeV和TypeVI。而NmeCas9属于TypeII-C类型，其主要作用模式是在sgRNA和PAM的帮助下特异剪切DNA双链，引入DNA的双链断裂，从而对特异位点进行编辑。其中NmeCas9又分为Nme1Cas9、Nme2Cas9和Nme3Cas9。细胞实验已经证明了Nme1Cas9和Nme2Cas9能够发挥核酸酶的功能。而Nme2Cas9与Nme1Cas9相比以下优点：(1)可以高效的切割DNA双链；(2)可以依赖N4CC的PAM进行靶标识别，扩展了CRISPR系统的可编辑范围。

但细胞和动物实验所使用的Nme2Cas9蛋白是从脑膜炎双球菌中分离出来的，而原核生物和真核生物存在不同的密码子偏好性和碱基组成。例如以水稻为代表的单子叶植物，较细菌及双子叶植物等物种，密码子偏好性强，并且GC含量高。因此直接使用未经人工优化设计的Nme2Cas9，会影响其在真核细胞中的表达效率，从而影响其对DNA双链的切割效率。此外，由于Nme2Cas9来自于细菌，可能对真核转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因及其在植物基因组编辑中的应用，

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因，所述密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

本发明第二方面提供一种表达盒，所述表达盒含有如上所述的密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因。

本发明第三方面提供一种表达载体，所述表达载体插入有如上所述的密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因或如上所述的表达盒。

本发明第四方面提供一种打靶载体，该打靶载体插入有如上所述的密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因或如上所述的表达盒以及靶位点序列。

本发明第五方面提供一种转基因细胞，所述转基因细胞转入有如上所述的密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因、如上所述的表达盒、如上所述的表达载体或如上所述的打靶载体。

本发明第六方面提供如上所述的密码子植物化改造的Plant Nme2Cas9基因、如上所述的表达盒、如上所述的表达载体、如上所述的打靶载体或如上所述的转基因细胞在植物基因组编辑中的应用，其中，所述植物基因组编辑包括对植物基因组进行剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

本发明第七方面提供一种获得含有突变位点的转基因水稻或水稻部分的方法，该方法包括：

(1)将如上所述的打靶载体转化根癌农杆菌，获得根癌农杆菌的转基因细胞；