[发明专利]ND4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种包含ND4基因表达盒的重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体的骨架为pAAV9，所述ND4基因表达盒包含人ND4基因或优化的人ND4基因。本发明还公开了该重组腺相关病毒载体的制备方法和应用。本发明将pAAV9作为ND4的基因载体，将ND4转导至病人眼中时，在确保安全性的同时，在视网膜上的表达量更高，具有更高的转导效率和高效的表达能力，感染视神经细胞的能力更强。将其制备为玻璃体腔注射的药物，能够增强该基因在Leber’s基因治疗中效果，并且可以减少注射剂量和缩短治愈时间。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种ND4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用。

背景技术

Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一种主要累及黄斑乳头束纤维，导致视神经退行性变的线粒体遗传性疾病。本病好发于青中年男性，临床表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，同时可伴有中心视野缺损及色觉障碍。

LHON由线粒体位点突变引起，我国学者已初步确认中国95﹪以上的LHON患者分别与线粒体DNA中11778、14484和3460的位点突变有关，其中11778位点突变最常见，占我国LHON的89.2％，且预后最差。线粒体DNA的11778位点突变的发病机制是，线粒体DNA(mtDNA)第11778位的核苷酸发生突变引起的，即鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A)，此突变使呼吸链上NADH脱氢酶亚单位4中(ND4)基因编码的第340位氨基酸由精氨酸变为组氨酸。虽然它们均为碱性氨基酸，但这一位置的精氨酸是高度保守的。由于突变可能降低电子流动效率影响酶的活性从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生LHON。

LHON目前尚无方法治疗，是世界公认的青少年致盲眼病之一，随着基因治疗的发展，LHON的基因治疗成为可能，其中的难点在于转染的基因进入细胞核，而LHON的突变位点在线粒体DNA，是线粒体中的ND4异常所致。

国内外已有公司或机构利用这一技术，利用腺相关病毒(adenovirus associatedvirus)pAAV2包装该核酸序列(参见CN102634527B)为基因药物，用于实验研究和临床试验，已取得初步成效。但是利用pAAV2的转导效率低，严重依赖HSP，而且表达缓慢，并会被可溶性肝素所抑制，而且只能到达视网膜浅层。因此急需一种转导效率更高、表达迅速的ND4重组表达载体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中pAAV2包装NADH脱氢酶亚单位4(ND4)序列为基因药物时转导效率低、表达缓慢等缺陷，提供一种ND4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用。本发明将pAAV9作为ND4的基因载体，将ND4转导至病人眼中时，在确保安全性的同时，在视网膜上的表达量更高，具有更高的转导效率和高效的表达能力，感染视神经细胞的能力更强。将其制备为玻璃体腔注射的药物，能够增强该基因在Leber’s基因治疗中效果，并且可以减少注射剂量和缩短治愈时间。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种包含ND4基因表达盒的重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体的骨架为pAAV9(即，9型重组腺相关病毒载体)，所述ND4基因表达盒包含人ND4基因或优化的人ND4基因。

较佳地，所述ND4基因表达盒从N端至C端依次包含启动子、线粒体靶向序列、人ND4基因或优化的人ND4基因、和/或UTR序列。

较佳地，所述启动子为CMV启动子或CAG启动子；所述启动子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示。

本发明中，所述线粒体靶向序列(MTS)可以为未经优化的MTS序列，可以为优化后的MTS序列。较佳地，所述线粒体靶向序列(MTS)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示；和/或，所述UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。