[发明专利]DNA纳米球及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种DNA纳米球及其制备方法和应用。所述DNA纳米球中结合有具有胡斯坦面结构的物质。通过利用具有胡斯坦面结构的物质和至少两个扩增引物对环状单链DNA进行滚环扩增，或者利用具有胡斯坦面结构的物质对环状单链DNA进行滚环扩增，能够获得该DNA纳米球。通过本发明所提供的方法制备DNA纳米球，用于测序具有降低的重复序列比例和提高的测序质量。

技术领域

本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种DNA纳米球及其制备方法和应用。

背景技术

DNA nanoball sequencing(DNA nanoball，DNB测序)，是一种高通量测序技术，可以用于测定生命体全基因组序列的排列与组成。该技术核心在于将基因组DNA片段环化成单链环状DNA后，通过滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)技术，使环状单链DNA形成由首尾相连的多个拷贝的单链DNA，并在溶液中自由折叠成纳米球结构，即DNA纳米球(DNB)。DNA纳米球由于自身所带负电荷的相互排斥，可减少DNB个体之间的相互作用，使DNB个体间相互独立。基于DNA nanoball的矩阵列测序技术使得每个矩阵点的DNB具有至少几百个拷贝数，这些拷贝聚集在一起产生强烈的信号，由此可以测序获得DNB的测序结果。

然而，针对DNB测序技术的测序质量还需要进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种DNA纳米球及其制备方法和应用。

评价不同测序技术的一个重要的指标就是Duplicate值(Dup值)的大小。在二代测序中，Dup值特指测序所得到的重复序列的比例。评价是否为重复序列，需要满足两个条件：1)reads比对到基因组的位置与碱基是否完全一致，2)是比对到参考基因组的方向是否完全一致。同时满足这两点一致的时候，就被认为是duplicate。在研究过程中，发现产生dup的原因主要有：第一种是样品dup，一些物种基因组结构本身比较复杂，存在多处重复序列，使样品在构建文库前本身就形成了dup；第二种是文库dup，产生的原因是在构建文库过程中，一些相同片段的序列被扩增；第三种是光学dup，产生的主要原因是同一个大的DNB的reads被误识别成不同的DNB的时候，此时他们距离应该很近本来是一组数据，但是却产生了多组数据；第四种是由于DNB的形态结构或大小导致，使邻近的DNB区域被占据，从而产生了多组数据。其中第一种dup的产生是固定的，与样品的物种来源有关。第二种dup可以通过控制文库建库方法。第三种和第四种dup，在不考虑成本的情况下，可以通过提高测序仪光学成像设备适当地改善和调节DNB的大小和形态结构；但是在大规模测序或者说在高通量测序的过程中，测序成本的控制对于测序的生产应用很重要，由此，如何在控制合适成本的前提下，例如基于当前的光学系统，降低测序过程中产生的Dup值，提高测序的质量至关重要。

本发明的发明人针对在DNA纳米球高通量测序的研究过程中发现：为了能够降低测序过程中所产生的Dup值，通常通过缩短RCA时间来达到相应的目的。但是这种处理方式同时也会带来很多缺点，例如第一，缩短RCA的时间，会影响DNB的测序质量，尤其是矩阵密度高的测序芯片。扩增时间短，尽管可以有效的降低dup值，但会导致DNB的拷贝数降低，使碱基的有效信号值降低。第二，缩短RCA的时间，所获得的纳米球无法满足需要的测序读长。读长较长的测序需要较长片段的文库，缩短滚环扩增时间后，DNB拷贝数无法满足测序需求。因此，如何既能保证纳米球的拷贝数，又不会使得建库测序过程中所产生的Dup值过高来满足精准测序的要求，至关重要。