[发明专利]一种利用三重实时荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种利用三重实时荧光定量RT‑PCR检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法。本发明结合相关蚊媒病原体出现的几率、流行的风险和实验室检测过程的可操作性，采用马雅罗病毒替代现有常用组合检测方案中的登革病毒，形成以寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒为检测靶标的新的检测方案。本发明提供了可同时鉴别经伊蚊传播、引发疾病临床症状相似的病毒性病原体寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的特异性引物、探针以及三重实时荧光定量RT‑PCR检测方法，该方法具有较高的特异性和灵敏性，可重复性好，检测简便快速、节约成本，可与传统检测方案互补，具有较高的应用价值。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于三重实时荧光定量RT-PCR同时检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的特异性引物和探针，本发明还涉及利用特异性引物、探针进行三重实时荧光定量RT-PCR同时检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法和试剂盒。

背景技术

蚊传病毒病，尤其是伊蚊传播的病毒病，是全球当前危害最严重的传染病，引发疾病主要包括登革热、寨卡病毒病、基孔肯雅热和马雅罗病毒病等，引起全球广泛关注。

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flaviviruses)，其直径约为42-52nm，是有包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约10.7kb，包含有单一的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码三种结构蛋白(衣壳蛋白C，前膜蛋白PrM/膜蛋白M和包膜蛋白E)和七种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)，编码顺序为：5’-UTR-C-PrM/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3’。系统发生分析显示，ZIKV分为两个亚型，分别为Africa Lineage和Asian Lineage。其中，在2015年以来美洲地区发生的病例大部分属于Asian Lineage。2016年2月，因巴西密集出现的新生儿小头症病例和其他神经系统病变，WHO宣布寨卡病毒病为“国际关注的突发公共卫生事件”，反映了该病的潜在危害的严重性。

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)和马雅罗病毒(Mayaro virus，MAYV)同属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)，直径约60-70nm，是不分节段的有包膜的单股正链RNA病毒，基因组长度约为11-12kb。其RNA链上有两个ORF，中间由长度约68个核苷酸的非编码区相连接，靠近5’端的ORF编码4种非结构蛋白(NS1，NS2，NS3和NS4)，靠近3’端的ORF编码5种结构蛋白(衣壳蛋白C，包膜蛋白E3，包膜蛋白E2，6K和包膜蛋白E1)，基因的编码顺序为5’-UTR-NS1-NS2-NS3-NS4-(junction region)-C-E3-E2-6K-E1-UTR-3’。系统发生分析显示，CHIKV有三个亚型，分别为West Lineage、East/Central/SouthAfrica(ECSA)和Asian Lineage，其中，在2006年以来印度洋区域(Indian Ocean)暴发的病例起源于ECSA，属于ECSA.IOL。MAYV主要发生在南美洲，有三个基因亚型，分别为GenetypeL、Genetype D和Genetype N，L基因亚型主要发生于巴西地区，D基因亚型广泛分布于美洲地区，N基因亚型目前仅在Peru发现一株。