[发明专利]一种利用三重实时荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法

权利要求书

1.用于寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的三重实时荧光定量RT-PCR检测的引物探针组合，其特征在于，由三对特异性引物和三条特异性探针组成，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7-9所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；

所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LCRED640、LC RED705中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQID NO.9所示的特异性探针的5’端标记Texas Red荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团。

4.权利要求1～3任一项所述的引物探针组合在制备用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的试剂盒中的应用。

5.一种用于寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的引物探针组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在进行三重实时荧光定量RT-PCR检测时的反应程序为：50℃预变性30min；95℃变性10min；95℃退火10s，60℃延伸45s，45个循环。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在进行三重实时荧光定量RT-PCR检测时的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，20μmol/L上、下游特异性引物各0.25μL，20μmol/L特异性探针各0.125μL，25×RT-PCR逆转录酶和DNA聚合酶1μL，RNA模板5μL，用无RNA酶去离子水补至25μL。

8.一种非疾病诊断目的的利用三重实时荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒方法，其特征在于，以待测样品的RNA为检测模板，利用如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物和如SEQ ID NO.7-9所示的特异性探针进行三重实时荧光定量RT-PCR，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述三重实时荧光定量RT-PCR的反应程序为：50℃预变性30min；95℃变性10min；95℃退火10s，60℃延伸45s，45个循环；

所述三重实时荧光定量RT-PCR的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，20μmol/L上、下游特异性引物各0.25μL，20μmol/L特异性探针各0.125μL，25×RT-PCR逆转录酶和DNA聚合酶1μL，RNA模板5μL，RNase Free Water补足至25μL。