[发明专利]结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC及其制备方法和应用。本发明提供的结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC为EAST6‑EAST6‑CFP10‑CFP10，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。重组融合蛋白EECC具有优异的抗原性，在进行结核病诊断时，在保证较高特异性的同时具有更高的灵敏度，可有效降低使用剂量，降低检测成本，有效区分诊断结核菌活菌感染、死菌致敏、BCG接种，可用于结核病诊断、结核病疫苗制备、抗原特异的细胞因子的检测，具有较好的推广应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术制备的结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC、编码该蛋白的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞，以及该融合蛋白的制备方法和应用。

背景技术

针对病原菌的结核病诊断方法包括抗酸染色镜检、菌种培养、基于PCR扩增的分子生物学诊断方法等；然而，针对病原菌的诊断方法不适用于菌阴结核病患者的诊断，而尽管我国结核病患者在缓慢降低，但菌阴结核病患者在升高(已到达80％)，这部分患者迫切需要建立免疫学诊断方法，以鉴别结核菌感染还是非结核分枝菌感染。针对结核感染人群需要进行管理，包括研制新疫苗预防和治疗，需要建立结核潜伏感染的诊断方法。免疫学诊断方法是基于免疫学原理诊断机体的免疫状态，分为免疫血清学诊断和免疫细胞学诊断。结核病血清学诊断价值受到质疑，WHO不推荐血清学诊断。免疫细胞学诊断方法有传统结核菌素试验(TST)和新建立的干扰素释放试验(IGRA)。TST试验是结核分枝杆菌纯蛋白衍生物进行皮内注射(孟都法)，72小时测量注射皮肤红肿或硬结反应横纵直径。IGRA是通过外周血或其分离的单核淋巴细胞在体外经结核分枝杆菌RD1区蛋白多肽刺激，检测分泌的IFN-γ。WHO在2018年结核病年报首次推荐TST或IGRA作为结核潜伏感染的诊断方法(WHO，TBreport，2018)。

IGRA分为ELISA-IGRA和ELISPOT-IGRA两种，所用体外刺激表位多肽是通过仪器合成，相对来说成本较高；ELISA-IGRA是外周血体外经RD1区抗原表位肽体外刺激培养，ELISA检测培养上清的IFN-γ含量；ELISPOT-IGRA是提取外周血的单核淋巴细胞体外经RD1区抗原表位肽体外刺激培养，酶联斑点法检测分泌IFN-γ的细胞数。ELISPOT-IGRA操作较复杂，成本高，需要生物安全柜、离心机、细胞计数仪、CO₂培养箱、斑点计数仪等仪器设备，还需要淋巴细胞分离液、细胞培养液、血清、离心管等试剂和耗材，实验操作需要6小时；ELISA-IGRA需要生物安全柜、离心机、培养箱、酶标仪，需要购买ELISA-IFN-γ试剂盒。ELISPOT-IGRA灵敏度高但不适合大规模筛查，ELISA-IGRA适合大规模筛查但部分数据在灰区，很难鉴定阳性还是阴性。由于IGRA的检测成本高、对设备和实验操作者要求较高，该方法不适合发展中国家进行基层推广。而皮肤试验只需注射和测量，从业人员经过培训均能很快掌握，适合随时和大规模筛查。

结核病的皮肤试验(皮试实验)，最早采用旧结核菌素(OT)皮试，OT皮试易产生副反应和非特异性反应。第二代皮试试剂为结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD或BCG-PPD)，TB-PPD或BCG-PPD皮试与OT相比减少了副反应；TB-PPD或BCG-PPD是由结核菌或BCG培养8-10周，培养物经121℃灭菌30min，过滤的滤液经三氯醋酸、饱和硫酸铵沉淀，沉淀复溶后透析得到；除蛋白衍生物外，还包含结核菌或BCG代谢产物，如菌体多糖、核酸、脂类及培养基的一些成份。PPD抗原与几乎所有分枝杆菌具有共同抗原，因此，PPD皮试试验仍存在特异性低的问题，对于BCG免疫接种国家，PPD作为结核病流行病学调查时，无法区分结核菌感染还是BCG接种、或暴露的分枝杆菌感染引起。第三代皮试试剂为重组蛋白，BCG表达量低于结核菌的蛋白38KD用于结核病诊断，可以提高诊断的特异度(He XY,et al.,Scand J InfectDis,2008；用于结核病诊断的结核分枝杆菌蛋白，专利号：ZL200410044568.X)，但与BCG接种存在一定交叉。