[发明专利]用于转基因水稻筛查的通用阳性标准质粒及其构建方法

说明书

本发明公开了用于转基因水稻筛查的通用阳性标准质粒及其构建方法；所述通用阳性标准质粒包括载体骨架和筛选元件，所述的筛选元件包括CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子、NOS终止子、CaMV35S终止子、Bar基因、HPT基因、Bt基因、SPS基因和PLD基因。本发明进一步公开了构建所述通用阳性标准质粒的方法及其在转基因水稻筛查、检测和监测中的应用。在转基因水稻筛查检测时，采用本发明提供的通用阳性标准质粒作为阳性对照品和质控样品可检测多种转基因水稻，具有适用性宽、覆盖面广泛等特点。

技术领域

本发明涉及通用阳性标准质粒，尤其涉及用于转基因水稻筛查的通用阳性标准质粒，本发明进一步涉及该通用阳性标准质粒构建方法及其在转基因水稻筛查、检测和监测中的应用，属于转基因水稻筛查的通用阳性标准质粒的构建和应用领域。

背景技术

随着全球转基因生物研发及商业化的迅猛发展，越来越多的转基因作物在不同的国家和地区被批准商业化种植。就水稻而言，目前已有许多抗虫、抗病、耐除草剂及营养成分改良的转基因水稻研发成功。但转基因作物在带来巨大的社会经济效益的同时，也存在潜在的环境和食品安全问题，一直以来饱受争议。

水稻作为重要的粮食作物，目前仅转基因抗虫水稻品种华恢1号及其杂交种Bt汕优63在2009年获得中国农业部颁发的生产应用安全证书，且并未获批进行商业化种植。但从2005年起，国际和中国国内都陆续发现水稻被LLRICE601、Bt汕优63、科丰6号和克螟稻等转基因成分污染的现象。且随着生物技术产业的快速发展，获批的和处于田间试验阶段的转基因作物越来越多，转基因作物意外或故意泄漏的风险也随之加大，对环境和食品安全造成威胁，也极易引起民众恐慌和贸易纠纷。因此，加强对转基因水稻的筛查、检测和监管尤为重要。

在日常检测过程中，阳性标准物质是检测过程中的标尺，但以植物原材料制备标准物质的操作过程复杂，且对环境和仪器设备的要求也比较高。且在转基因筛查检测过程中，很多检测机构是根据检测的靶标选用含有相应靶标的转化事件特异性检测用标准物质作为阳性对照，这样筛查检测中针对多个检测靶标需要多个阳性对照，提高了检测成本，也给检测工作增添不便。

2002年，日本科学家Kuribara H提出的阳性质粒标准物质可以不依赖原材料，采用基因合成技术就可以将多个外源目的基因共同构建入一个质粒分子中，并通过微生物进行存储和大量培养。质粒DNA提取容易且纯度较高，可以有效解决阳性标准品匮乏和制备困难的问题，给检测工作带来便利。因此开发一种针对转基因水稻筛查检测用阳性质粒分子具有重要的意义。

目前已有部分专利和文献报道了转基因水稻筛查的重组标准质粒，例如汪小福等于2013年利用重叠PCR技术将CaMV35S启动子、SPS基因、Bt基因、NPTⅡ基因、Htp基因、Bar基因和NOS终止子片段克隆构建到载体pUC-19中，获得转基因水稻筛查的重组标准质粒pUC-RS(发明名称：一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒及试剂盒；专利申请公开号：CN103215346A)。以及李晓飞等于2013年将CaMV35S启动子、NOS终止子，标记基因Bar、HPT和NPTⅡ基因作为转基因水稻的筛查检测靶标构建了质粒分子pBS Rice用于转基因水稻的检测(李晓飞等.转基因水稻检测用阳性质粒分子的构建及应用，2013)。

但是，现有的用于筛查检测转基因水稻的阳性质粒分子不同程度的存在元件的靶标序列适用性较窄、覆盖面不够广泛等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种可筛查检测转基因水稻的阳性质粒分子，在转基因水稻筛查检测时，用其作为阳性对照品和质控样品可检测多种转基因水稻，具有适用性宽、覆盖面更为广泛等优点。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：