[发明专利]一种Nrf2基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种Nrf2基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用，本发明要求保护Nrf2基因缺失的斑马鱼在监测水体拟除虫菊脂农药污染和/或拟除虫菊脂农药毒理研究中的应用。本发明利用Nrf2基因，成功构建了一种Nrf2基因缺失的斑马鱼，Nrf2基因缺失的斑马鱼对于除虫菊脂高度敏感，可以作为用于监测水体拟除虫菊脂农药污染，以及拟除虫菊脂农药毒理研究。本发明构建的Nrf2基因缺失的斑马鱼具有很好的应用前景，值得大力推广。

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，更具体地，涉及一种Nrf2基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用。

背景技术

拟除虫菊酯类农药是模拟天然除虫菊素由人工合成的一类杀虫剂，有效成分是天然菊素。主要用于防治农业害虫。拟除虫菊酯类农药的大量使用，也会使多种害虫产生抗药性，而带来严重的环境污染的同时严重的危害了人类和其他动物的安全。随着拟除虫菊酯类农药在农业上广泛的使用，随着水体的循环，不可避免的在湖泊河流中广泛存在并积累。虽然拟除虫菊酯类农药对哺乳动物毒性较低，但是有数据显示对水体动物的毒性是哺乳动物的1000多倍，因此拟除虫菊酯类农药水体内的生物造成了严重的毒害作用，但是目前尚无一种灵敏的检测水体内的拟除虫菊酯类农药的生物学手段。

CRISPR/Cas系统具有编辑DNA的功能，是近年来得到快速发展的一项用于基因编辑的工具，有着比传统基因编辑技术ZFNs(zinc-finger nucleases)和TALENs(transcription activator-like effectors)更便利，应用更广的优点。Ⅱ型CRISPR/Cas系统(The typeⅡclustered regularly interspaced short palindromic repeatssystem/CRISPR-associated)来自于Streptococcus pyogenes，是属于原核生物适应性免疫的一部分，保护细菌和古生菌避免入侵性病毒和质粒的伤害。Cas9是Ⅱ型CRISPR/Cas系统的一部分，能够在gRNA的引导下对外源性DNA进行剪切(Cong et al 2013)。在斑马鱼胚胎中，使用Cas9/gRNA system可有效的进行特异性位点的切割，导致非同源末端连接介导的插入或缺失，或通过HDR机制在基因组中引入一小段外源DNA。本实验参考Jing-WeiXiong等的方法，在斑马鱼胚胎中进行基因的敲除(Chang et al 2013)。

转录因子nuclear factor erythroid 2(NF-E2)-related factor 2(nrf2)是一个氧化还原反应的关键调控因子，同时还与药物/异生物质代谢、DNA修复、线粒体功能以及多种物质代谢包括铁、脂质和碳水化合物代谢相关，此外，还参与到蛋白稳态和增殖活动中，总体而言，Nrf2可能对细胞存活有重要作用。在斑马鱼中，nrf2由5个外显子编码。

斑马鱼作为一种典型的模型生物，具有个体小，生长周期短，繁殖快等优点。斑马鱼在性成熟后可长至3到4厘米，和其它鱼类相比，个体较小，适合在实验室条件下进行饲养。而且在实验室条件下，斑马鱼的繁殖已经非常成熟可控以及便利，一尾性成熟的雌性斑马鱼一次能产数百颗卵，而且产卵频率为一周一次，在获取实验材料上非常便捷。另，斑马鱼的基因组测序早已完成，遗传背景清晰，在进行基因编辑上有很大的便利和优势。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种Nrf2基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用。

本发明的第一个目的是提供nrf2基因缺失的斑马鱼在监测水体拟除虫菊脂农药污染和/或拟除虫菊脂农药毒理研究中的应用。

本发明的第二个目的是提供一个用于构建nrf2基因缺失的斑马鱼的靶位点。

本发明的第三个目的是提供所述靶位点在构建nrf2基因缺失的斑马鱼中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种拟除虫菊脂敏感型斑马鱼的制备方法。