[发明专利]倍半萜环化酶基因peniA及其在酵母中异源表达合成silphinene的方法

说明书

本发明公开了倍半萜环化酶基因peniA及其重组表达载体和应用，倍半萜环化酶基因peniA的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，本发明通过在酵母体内异源表达peniA基因，对其催化产物进行了分离及结构鉴定，表明倍半萜环化酶基因peniA可在酵母中合成角三环倍半萜silphinene；同时，还在大肠杆菌中表达peniA基因，获得可溶性的PeniA重组蛋白也具有催化底物FPP反应生成silphinene的活性，因此可用于体内或体外合成silphinene。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及倍半萜环化酶基因peniA，还涉及该基因在酵母中异源表达合成silphinene的方法。

背景技术

倍半萜类天然产物生物合成途径中，涉及到的酶催化反应中最关键的酶为倍半萜环化酶，其能够催化线性前体FPP的C-O键的断裂，形成烯丙基碳正离子，进而引发一系列的C-C键生成或重排的环化反应形成不同的倍半萜骨架，包括单环、双螺环、双并环及三环等。目前植物来源的倍半萜环化酶研究报道较多，而真菌来源的则相对较少，但是基于对JGI数据库中所测序的真菌基因组中萜类环化酶的生物信息学分析显示，倍半萜合成酶是最主要的环化酶类型。随着基因组测序技术及生物信息学分析手段的快速发展，为真菌倍半萜环化酶的发现及其功能研究提供了前所未有的机会。因此，急需对真菌倍半萜环化酶合成基因进行研究，对阐明真菌合成倍半萜类化合物机理具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种倍半萜环化酶基因peniA；本发明的目的之二在于提供含有倍半萜环化酶基因peniA的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供所述的倍半萜环化酶基因peniA或所述重组表达载体在酵母中合成角三环倍半萜silphinene中的应用；本发明的目的之四在于提供通过在酵母中表达倍半萜环化酶基因peniA合成角三环倍半萜silphinene的方法；本发明的目的之五在于提供利用所述倍半萜环化酶基因peniA表达PeniA重组蛋白的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种倍半萜环化酶基因peniA，所述倍半萜环化酶基因peniA的核酸序列如SEQID NO.3所示。

2、含有所述倍半萜环化酶基因peniA的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体由peniA基因通过NdeⅠ和PmlⅠ连接到酵母表达载体pYEU上而得。

3、所述的倍半萜环化酶基因peniA或所述的重组表达载体在酵母中合成角三环倍半萜silphinene中的应用。

4、通过在酵母中表达倍半萜环化酶基因peniA合成角三环倍半萜silphinene的方法，包括如下步骤：将peniA基因通过NdeⅠ和PmlⅠ连接到酵母表达载体pYEU上，得到重组质粒pCMU 1，然后将重组质粒pCMU 1转化酵母，获得含有重组质粒pCMU 1的菌株，经发酵培养，即获得含有角三环倍半萜silphinene的发酵液。

优选的，发酵培养后还包括分离纯化，具体为：将发酵液离心收集菌体，经收集的菌体用乙酸乙酯提取，上清用正己烷萃取，减压浓缩，获得浸膏；再将浸膏采用凝胶柱分离，洗脱溶剂为体积比为1：1的正己烷-二氯甲烷，最终分离得到角三环倍半萜silphinene纯品。

优选的，所述酵母为入酵母BJ 5465-NpgA。

优选的，所述凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱。

优选的，所述乙酸乙酯提取为将菌体用乙酸乙酯反复提取3次。

优选的，所述萃取为使用正己烷萃取三遍。