[发明专利]倍半萜环化酶基因peniA及其在酵母中异源表达合成silphinene的方法

权利要求书

1.一种倍半萜环化酶基因peniA，其特征在于：所述倍半萜环化酶基因peniA的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.含有权利要求1所述倍半萜环化酶基因peniA的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由peniA基因通过NdeⅠ和PmlⅠ连接到酵母表达载体pYEU上而得。

4.权利要求1所述的倍半萜环化酶基因peniA或权利要求2~3任一项所述的重组表达载体在酵母中合成角三环倍半萜silphinene中的应用。

5.通过在酵母中表达倍半萜环化酶基因peniA合成角三环倍半萜silphinene的方法，其特征在于，包括如下步骤：将peniA基因通过NdeⅠ和PmlⅠ连接到酵母表达载体pYEU上，得到重组质粒 pCMU 1，然后将重组质粒 pCMU 1转化酵母，获得含有重组质粒 pCMU 1的菌株，经发酵培养，即获得含有角三环倍半萜silphinene的发酵液；所述倍半萜环化酶基因peniA的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：发酵培养后还包括分离纯化，具体为：将发酵液离心收集菌体，经收集的菌体用乙酸乙酯提取，上清用正己烷萃取，减压浓缩，获得浸膏；再将浸膏采用凝胶柱分离，洗脱溶剂为正己烷与二氯甲烷体积比为1：1的混合溶液，最终分离得到角三环倍半萜silphinene纯品。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述酵母为酵母BJ 5465-NpgA。

8.根据权利要求 6所述的方法，其特征在于：所述凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱。

9.利用权利要求1所述倍半萜环化酶基因peniA表达PeniA重组蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：将倍半萜环化酶基因peniA通过NdeI和Hind Ⅲ连入表达载体pColdI上，得到重组质粒 pCMU 2，然后将含重组质粒 pCMU 2的大肠杆菌BL 21阳性转化子进行蛋白的诱导表达，纯化获得PeniA重组蛋白。

10.根据权利要求9所述倍半萜环化酶基因peniA表达PeniA重组蛋白的方法，其特征在于：所述纯化为离心收集菌体，加入Buffer重悬，冰水浴上超声裂解菌体；离心收集上清，用0.22 μm滤膜过滤，加入到Buffer平衡的镍柱中，先用适量50 mM低浓度咪唑洗脱液除去杂蛋白，再用250 mM浓度咪唑洗脱液洗脱PeniA蛋白，收集流出液，获得PeniA重组蛋白。