[发明专利]一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法及其应用

权利要求书

1.一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法，其特征在于，

所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码基因序列为LRITS2/LRpsbA-trnH。

2.根据权利要求1所述一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法，其特征在于，所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码基因序列LRITS2如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

3.根据权利要求1所述一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法，其特征在于，所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码基因序列LRpsbA-trnH如SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

4.如权利要求1所述一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(一)DNA的提取

分别取0.5g的黑果枸杞干净无霉变的果实和果实粉样本，作好标记后迅速放入液氮中，储存于-80℃冰箱中，备用；

样品基因组DNA采用CTAB法提取方法如下：

(1)研钵用液氮预冷，CTAB提取液于65℃预热，灭菌的2mL离心管置于冰上，备用；

(2)将样品放于研钵，加0.01g PVP后，加液氮研磨至粉末，边研磨边加入液氮；

(3)将粉末转入2mL离心管内，离心管内预加入800μL预热的CTAB提取液，1μL巯基乙醇，2‰，于65℃水浴1h，每隔10min轻摇一次，使其混合；

(4)向混合液中加入相同体积的酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1混合液，轻颠倒使其充分反应10min后，于4℃，12000rpm离心15min；

(5)离心后取上清，加2.5μL的RNase，10mg/mL，37℃保温1h，加入等体积氯仿/异戊醇24∶1，轻摇混匀10min，4℃，12000rpm离心15min。重复洗脱1次；

(6)离心后取上清，置入新的2mL EP离心管，加入2/3上清液体积的于-20℃预冷的异丙醇，1/10体积3M NaAC，pH＝5.2，混匀，-20℃放置1h或者过夜；

(7)取出放于冰上10min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

(8)沉淀物用70％的乙醇(200μL)漂洗，12000rpm离心5min，漂洗3次后，置于超净台晾干30min，用ddH₂O溶解；

提取好的DNA样品用NanoDrop 2000检测，并稀释为30ng/μL，储存于-20℃冰箱中，备用；

(二)PCR扩增

(1)PCR扩增引物和筛选

ITS2和psbA-trnH的通用引物，表1

表1 ITS2和psbA-trnH的通用引物

表2 DNA条形码反应体系

配制表1中20μL体系的PCR反应混合物。在1.5mL EP离心管中分别加入表2中物质，混匀后放入PCR扩增仪中，即得到DNA条形码基因序列为LRITS2/LRpsbA-trnH；

PCR循环反应条件设置如下：94℃，5min；30循环，94℃1min，55℃1min，72℃1.5min；72℃，7min；

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外凝胶成像系统下观察扩增结果，扩增结果表明，ITS2和psbA-trnH序列的长度均在500bp。

5.如权利要求1所述DNA条形码序列基因ITS2或psbA-trnH基因在鉴定黑果枸杞中的应用。

6.根据权利要求5所述一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法，其特征在于，所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码基因序列LRITS2/LRpsbA-trnH可以同时或任选其中之一用于鉴定黑果枸杞。